导读:本文包含了核糖体基因区打靶载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:人胚胎干细胞,基因打靶,核糖体基因区,血友病A
核糖体基因区打靶载体论文文献综述
李卓[1]（2013）在《核糖体基因区打靶载体介导FVⅢ打靶人胚胎干细胞及其定向分化研究》一文中研究指出人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)因其具有高度的自我更新特性和多向分化潜能,在再生医学、组织工程、基因治疗等领域都有着巨大的研究和应用潜力。近年来,随着基因打靶技术在人胚胎干细胞中的不断尝试,使得经基因组精确修饰后的干细胞有望成为实现遗传病治疗的有效方式。然而要充分实现联合基因打靶和干细胞两种技术在临床应用的可能,我们还需面对一些潜在的困难,例如自发同源重组介导基因打靶的低效性,基因组修饰后的安全性等问题。我们研究小组前期的实验证实,由本室研发的核糖体基因区(rDNA)打靶载体(pHrn)能有效介导外源基因定点整合至多种细胞系的rDNA区并有效表达,且一系列临床细胞遗传学的证据表明该区域可能是外源基因停泊的安全位点。在此基础上,本研究利用pHrn携带人凝血因子Ⅷ(FⅦ)表达框,对hESCs进行基因打靶,以期获得在rDNA区定点整合FⅧ的hESCs细胞克隆,并通过检测打靶后hESCs的干细胞特性是否改变来初步验证rDNA区打靶的安全性。然后将定点整合FⅧ的hESCs分化为适合血友病移植治疗的特定组织细胞,测定分化细胞的特性和生理功能,为联合rDNA区基因打靶及干细胞技术应用于血友病A的基因治疗提供基础。方法：(1)将pHrnFⅦ质粒线性化后,经电转和核转两种方式转染单细胞化的hESCs,梯度加入G418筛选抗性克隆；(2)挑取筛选出的抗性克隆,利用定点整合PCR及Southen Blot鉴定rDNA区定点整合FⅧ的阳性hESCs克隆；(3)检测定点整合FⅧ克隆的干细胞生物学特性,包括核型鉴定,碱性磷酸酶染色,干细胞表面标志物检测；(4)检测定点整合FⅧ克隆的多潜能性,包括体外定向心肌分化,体外随机向叁胚层细胞分化以及体内畸胎瘤形成等实验。(5)由于肝脏是FⅧ的主要合成及分泌器官,因此我们将定点整合FⅧ细胞克隆定向诱导为肝细胞,并通过形态学观测、细胞特异性基因表达、ICG代谢、PAS糖原染色等实验来验证分化后肝细胞的特性及生理功能；(6)我们还将定点整合FⅧ的细胞克隆定向诱导为目前广泛应用于体内移植治疗的间充质干细胞(MSCs),通过形态学观测、流式细胞分析、成骨分化、成脂分化、成软骨分化等验证分化后MSCs细胞的特性及生理功能；(7)RT-PCR及ELISA检测定点整合FⅧ的hESCs以及分化后的肝细胞和MSCs细胞中外源FⅧ的转录及蛋白表达。结果：(1)通过定点整合PCR及Southern Blot,我们获得了分别经电转和核转后定点整合Ⅷ的hESCs克隆各一个,分别命名为ET5及NT59；(2)两株细胞均保持正常核型且碱性磷酸酶阳性,并表达SSEA-4,TRA-1-60等hESCs特异性标志物,表明仍具备干细胞的特性；(3)体外分化结果显示两株细胞均能分化出Nestin、SMA、AFP标志物阳性的叁胚层细胞,同时体内畸胎瘤切片观测到了鳞状上皮、肌肉、消化道等叁胚层组织,表明打靶后细胞仍具备多向分化能力；(4)将ET5细胞进行定向肝细胞分化后,可见圆形或多边形等典型肝细胞样细胞；通过RT-PCR、 Western Blot、免疫荧光均检测到了AFP、AlbvAAT、CYP7A1、CYP3A4等肝细胞特异性基因的表达；分化而来的肝细胞能成功摄取及排泌ICG染料且PAS染色阳性,初步证明具备成熟肝细胞的代谢及糖原贮存功能；(5)ET5进行定向MSCs分化后的细胞,在多次传代后具有与BM-MSCs趋于一致的典型成纤维样形态,且增殖能力旺盛；流式分析结果表明分化而来的MSCs细胞表面抗原CD34, CD45阴性,CD44, CD73, CD90阳性,与BM-MSCs一致；经间充质系分化检测,显示分化而来的MSCs同样具备向成骨成脂成软骨的分化能力；(6)RT-PCR检测结果发现,在ET5、 ET5分化而来的肝细胞及MSCs细胞中均能检测到外源FⅧ的转录,但是ELISA结果仅检测到了分化后肝细胞中FⅧ蛋白的表达。结论：(1)通过rDNA区打靶载体成功将FⅧ表达框定点整合至hESCs的rDNA区；(2)定点整合FⅧ的hESCs仍然保持多向分化潜能；(3)成功将定点整合FⅧ的hESCs定向诱导为具备特定生理功能的肝细胞；(4)成功将定点整合FⅧ的hESCs定向诱导为MSCs,且与BM-MSCs细胞特性趋于一致,并具备多向分化潜能；(5)定点整合FⅧ的hESCs及其分化而来的肝细胞和MSCs能转录外源FⅦ mRNA,但仅在肝细胞中检测到分泌性FⅧ蛋白。(本文来源于《中南大学》期刊2013-12-01）
肖涤[2]（2011）在《核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究》一文中研究指出核糖体基因(rDNA)区可能是一个安全有效的基因打靶区域,我室基于此开发的非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向载体,能携带多种治疗基因在多种细胞系中成功打靶rDNA 18S区+5468位点,且外源基因能长期稳定地表达。进一步提高rDNA区的打靶效率可以更充分地发挥该区域作为基因治疗靶位点的潜能,尤其在打靶病人来源的原代细胞方面带来突破。近年来,锌指酶作为提高基因打靶效率的有力工具被广泛应用,甚至能将打靶效率提高5000倍以上。我室针对rDNA内部转录间隔1(ITS1)区+6523-+6546位点设计的锌指酶ZFN-S3,体内体外实验检测均表明其具有较高的切割双链DNA的活性。ZFN-S3可能是用于提高rDNA区打靶效率有效工具。目的：针对ZFN-S3的切割位点设计、构建核糖体基因区锌指酶位点靶向载体——pHr1-NL、pHr2-NL,证实该载体打靶rDNA区的可行性,为该载体联合锌指酶ZFN-S3高效打靶rDNA区奠定基础。方法：载体pHr1-NL的构建：首先用PCR法克隆约2kb的rDNA同源序列。然后将无启动子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷酸转移酶(Neo)基因亚克隆至同源序列的rDNA ITS1区,利用“启动子陷阱”策略富集同源重组子。并在Neo基因两侧加入同向的loxP位点,用于后续的特异性基因删除。载体pHr2-NL的构建：将pHr1-NL上rDNA+5513-+6523的同源序列替换成rDNA+937-+6523同源序列。将构建好的载体pHr1-NL、pHr2-NL利用核转染技术转染人类纤维肉瘤(HT1080)细胞,通过筛选、挑取和计数细胞克隆、鉴定定点整合等步骤,对其rDNA区的打靶进行研究。结果：1、构建的载体pHr1-NL经EcoR V、ClaⅠ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。2、构建的载体pHr2-NL经EcoR V、AatⅡ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。3、载体pHr1-NL、pHr2-NL的测序结果与理论序列相符。4、采用核转技术将pHr1-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了13个抗性克隆,并未获得定点整合克隆。5、采用核转技术将pHr2-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了12个抗性克隆,并获得了1个定点整合克隆。结论：构建的含loxP位点的核糖体基因区锌指酶位点靶向载体PHr2-NL能将Neo基因定点整合至rDNA ITS1区,为联合锌指酶ZFN-S3高效打靶hrDNA区奠定了基础。(本文来源于《中南大学》期刊2011-06-01）
曹善仁,刘慕君,刘雄昊,伍汇慧,邬玲仟[3]（2010）在《核糖体基因区打靶载体电转染肝细胞的孵育条件的优化》一文中研究指出目的:提高核糖体基因区打靶载体的转染效率,优化其电转染肝细胞的孵育条件。方法:在其它电转染参数一致的前提下,设计了6组不同的孵育条件,通过分析转染后细胞活率以及48h后目的基因GFP的表达效率,来比较多组不同的孵育条件对电转染效率的影响。结果:6组条件中,转染前21℃,1min,转染后21℃,1min孵育,得到的转染效率最优,比其它的条件得到的转染效率高50%。结论:孵育条件的优化能提高为核糖体基因区靶向表达载体在体外电转染肝细胞的转染效率。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2010年13期）
薛金锋,刘雄昊,何嫱,薛志刚,胡友金[4]（2009）在《人核糖体DNA打靶载体介导mda-7基因对肝癌的体外基因治疗研究(英文)》一文中研究指出人核糖体DNA打靶载体pHr是一种由中南大学医学遗传学国家重点实验室开发构建的针对人类基因组的同源重组质粒载体.利用pHr构建了一种mda-7/GFP融合基因的人源基因表达载体pHr-CMG,并研究了其在肝癌细胞系Bel-7402中的作用.利用荧光显微镜、RT-PCR和Western blotting检测了mda-7/GFP融合基因的表达;利用细胞周期分析、MTT和Hoechst33258染色研究了其在细胞中的作用.结果显示,pHr-CMG载体能在Bel-7402细胞中有效表达MDA-7/GFP融合蛋白,进而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,推测其可能是由载体表达了mda-7基因引起细胞在G2/M期累积所导致的.同时,实验结果证实了人核糖体DNA打靶载体系统以及pHr-CMG表达载体的有效性,为其在进一步基因治疗研究中的应用提供了理论和实验基础.(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2009年11期）
刘雄昊[5]（2007）在《利用携带人凝血因子Ⅷ的核糖体基因区打靶载体进行血友病A基因治疗的研究》一文中研究指出血友病A是一种X-连锁隐性遗传病，在男性中的发病率约为1-2／10000。血友病A的临床症状主要为自发性关节、软组织或其他组织的出血、血肿，常可致残，甚至危及生命。其致病机制是由于编码凝血因子Ⅷ(简称FⅧ)的基因先天性异常而导致的凝血因子Ⅷ缺乏或功能缺陷。血友病A是基因治疗的首选疾病之一。在血友病A基因治疗的研究中发现，重组的野生型FⅧ在细胞中的表达量较低，其主要原因有：第一，在FⅧcDNA结构中，有一段大约1.2kb的片段对mRNA的积累起抑制作用，相当于一个转录沉寂子或转录延伸阻遏子的作用，从而大大降低了FⅧ的表达水平。第二，FⅧ分子从内质网向高尔基体转移效率低会影响其分泌效率。第叁，合成以后的FⅧ分子极其敏感，极易受到蛋白酶的降解，需要与vWF因子结合才能稳定存在。研究表明，改造hFⅧ是提高hFⅧ在细胞中的表达量的一个有效途径。目前，对hFⅧ的改造主要集中在以下几个方面：1，缺失B区。2，去除其5’-UTR和3’-UTR。3，在hFⅧ基因中插入apoA-1内含子。我室已对hFⅧ进行了上述改造，将hFⅧ改造成了hFⅧ-BSP。在本研究中，一方面，为了进一步提高hFⅧ-BSP的翻译效率，将hFⅧ-BSP的ATG侧翼序列改成了Kozak序列；另一方面，为了提高hFⅧ-BSP的分泌效率，对其进行了定点诱变：L303E，F309S，从而将hFⅧ-BSP改造成hFⅧ-SK39。载体选择是目前基因治疗领域面临的主要问题。病毒载体因其体内、外转染效率均较高而成为基因治疗中广泛应用的载体，迄今为止，有70％的临床试验采用病毒载体，但病毒载体仍然存在安全性的问题。我室构建了一种新型的非病毒载体-pHrneo，与其他非病毒载体的最大区别在于，pHrneo具有定点整合能力。我室前期的研究表明，pHrneo能够将外源治疗性基因定点靶入到HT1080(人纤维肉瘤细胞)的核糖体基因区。在本研究中，首先，将hFⅧ-BSP改造成hFⅧ-SK39，采用电转染术将hFⅧ-BSP和hFⅧ-SK39的表达载体pcDBSP和pcDSK39分别转染HT1080细胞，经过G418筛选和PCR鉴定，获得阳性单克隆细胞；采用ELISA的方法检测hFⅧ-BSP和hFⅧ-SK39在HT1080细胞中的表达水平。然后，我们构建了携带有hFⅧ-SK39的核糖体基因区靶向表达载体：pHrneo-SK39。接下来，采用电转染术将pHrneo-SK39转染到HL7702(人肝细胞)中，经过G418筛选和PCR鉴定，获得定点整合细胞。然后，采用ELISA、Western blotting和一期法检测了定点整合细胞中hFⅧ-SK39表达情况，还检测了定点整合细胞的生长状况指标。在对其中一个定点整合细胞克隆进行连续传代50次的过程中，监测了hFⅧ-SK39的表达情况。最后，我们采用高水压注射法将pHrneo-SK39直接通过尾静脉注射到裸鼠体内，采用ELISA法检测了裸鼠中hFⅧ-SK39的表达情况，并进行了转氨酶、总胆红素的检测和肝组织的病理学检查。结果显示：1，hFⅧ-BSP改造成hFⅧ-SK39在HT1080细胞中的表达量分别为2.99±0.28 ng／10~6细胞／天和9.90±1.89 ng／10~6细胞／天，相比之下，hFⅧ-SK39具有表达优势。2，pHrneo-SK39将hFⅧ-SK39成功地靶入到HL7702细胞中的核糖体基因区，定点整合效率为1.1×10~(-5)。3，定点整合细胞中hFⅧ-SK39的表达量为4.3±0.9 ng／10~6细胞／天。而且定点整合细胞的生长状况没有发生改变。4，定点整合细胞能稳定表达hFⅧ-SK39。5，pHrneo-SK39能在裸鼠中进行有效表达，受试鼠中hFⅧ-SK39的最高浓度为4.56ng／ml。通过本课题的研究，我们积累了较为系统的关于pHrneo-SK39的实验数据，为将pHrneo-SK39应用到血友病A的基因治疗奠定了重要的研究基础。(本文来源于《中南大学》期刊2007-06-01）
王丽娜,薛志刚,李卓,薛金锋,刘雄昊[6]（2006）在《特异性核糖体基因区打靶载体介导CDUPRT治疗肝癌的体内外研究》一文中研究指出核糖体基因区打靶载体pHrn是本室构建的人源基因载体之一,为探讨其在肝癌基因治疗的作用,本研究构建了pHr-CeTpCDUPRT/GFP质粒载体并进行了肝癌的体内外治疗实验研究.该质粒载体以pHrn载体为骨架,CMV+hTERT启动子作为转录调控元件,CDUPRT/GFP自杀融合基因为目的基因.体外转染肝癌细胞BEL7402后,流式细胞仪检测转染效率为30%~50%;RT-PCR和Westernblotting结果表明,有CDUPRT表达;HPLC检测5-FC可转化为5-FU,给药后12h5-FU浓度达60.15μg/mL;四唑盐(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)分析结果显示,200~800μg/mL5-FC使BEL7402的平均存活率为60%~35%.同时,对裸鼠肝癌模型进行瘤内转染,结果显示,当持续注射质粒和前体药物治疗时,裸鼠肿瘤生长明显被抑制,甚至体积稍有缩小;RT-PCR检测结果表明,瘤内有CDUPRT表达;HPLC检测裸鼠血清中的5-FU浓度为7.694μg/mL;肿瘤组织病理切片显示,大量肿瘤细胞坏死.这些结果为实际应用此载体进行肝癌基因治疗提供了重要的实验依据.(本文来源于《科学通报》期刊2006年18期）
刘雄昊,刘慕君,佘华,文路,薛志刚[7]（2005）在《利用核糖体基因区打靶载体靶向表达改造型人凝血因子Ⅷ》一文中研究指出构建了携带改造型hFⅧ(hFⅧ-BDDAK39)的核糖体基因区靶向表达载体pHrneo-BDDAK39,并将其转入人纤维肉瘤细胞(HT1080),检测其定点整合的能力及hFⅧ-BDDAK39的表达情况.结果显示,pHrneo-BDDAK39能够成功地将hFⅧ-BDDAK39靶入到HT1080细胞的核糖体基因区,定点整合效率达到2.0×10~(-5),并且靶入的hFⅧ-BDDAK39能有效表达,表达量为(32±5)ng·10~6细胞~-1·24h~(-1).这为利用此靶向表达载体进行血友病A的基因治疗提供了重要的实验依据.(本文来源于《科学通报》期刊2005年18期）
核糖体基因区打靶载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
核糖体基因(rDNA)区可能是一个安全有效的基因打靶区域,我室基于此开发的非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向载体,能携带多种治疗基因在多种细胞系中成功打靶rDNA 18S区+5468位点,且外源基因能长期稳定地表达。进一步提高rDNA区的打靶效率可以更充分地发挥该区域作为基因治疗靶位点的潜能,尤其在打靶病人来源的原代细胞方面带来突破。近年来,锌指酶作为提高基因打靶效率的有力工具被广泛应用,甚至能将打靶效率提高5000倍以上。我室针对rDNA内部转录间隔1(ITS1)区+6523-+6546位点设计的锌指酶ZFN-S3,体内体外实验检测均表明其具有较高的切割双链DNA的活性。ZFN-S3可能是用于提高rDNA区打靶效率有效工具。目的：针对ZFN-S3的切割位点设计、构建核糖体基因区锌指酶位点靶向载体——pHr1-NL、pHr2-NL,证实该载体打靶rDNA区的可行性,为该载体联合锌指酶ZFN-S3高效打靶rDNA区奠定基础。方法：载体pHr1-NL的构建：首先用PCR法克隆约2kb的rDNA同源序列。然后将无启动子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷酸转移酶(Neo)基因亚克隆至同源序列的rDNA ITS1区,利用“启动子陷阱”策略富集同源重组子。并在Neo基因两侧加入同向的loxP位点,用于后续的特异性基因删除。载体pHr2-NL的构建：将pHr1-NL上rDNA+5513-+6523的同源序列替换成rDNA+937-+6523同源序列。将构建好的载体pHr1-NL、pHr2-NL利用核转染技术转染人类纤维肉瘤(HT1080)细胞,通过筛选、挑取和计数细胞克隆、鉴定定点整合等步骤,对其rDNA区的打靶进行研究。结果：1、构建的载体pHr1-NL经EcoR V、ClaⅠ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。2、构建的载体pHr2-NL经EcoR V、AatⅡ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。3、载体pHr1-NL、pHr2-NL的测序结果与理论序列相符。4、采用核转技术将pHr1-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了13个抗性克隆,并未获得定点整合克隆。5、采用核转技术将pHr2-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了12个抗性克隆,并获得了1个定点整合克隆。结论：构建的含loxP位点的核糖体基因区锌指酶位点靶向载体PHr2-NL能将Neo基因定点整合至rDNA ITS1区,为联合锌指酶ZFN-S3高效打靶hrDNA区奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
核糖体基因区打靶载体论文参考文献
[1].李卓.核糖体基因区打靶载体介导FVⅢ打靶人胚胎干细胞及其定向分化研究[D].中南大学.2013
[2].肖涤.核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究[D].中南大学.2011
[3].曹善仁,刘慕君,刘雄昊,伍汇慧,邬玲仟.核糖体基因区打靶载体电转染肝细胞的孵育条件的优化[J].现代生物医学进展.2010
[4].薛金锋,刘雄昊,何嫱,薛志刚,胡友金.人核糖体DNA打靶载体介导mda-7基因对肝癌的体外基因治疗研究(英文)[J].生物化学与生物物理进展.2009
[5].刘雄昊.利用携带人凝血因子Ⅷ的核糖体基因区打靶载体进行血友病A基因治疗的研究[D].中南大学.2007
[6].王丽娜,薛志刚,李卓,薛金锋,刘雄昊.特异性核糖体基因区打靶载体介导CDUPRT治疗肝癌的体内外研究[J].科学通报.2006
[7].刘雄昊,刘慕君,佘华,文路,薛志刚.利用核糖体基因区打靶载体靶向表达改造型人凝血因子Ⅷ[J].科学通报.2005