下调热休克蛋白60对MDCC-MSB1细胞凋亡调节作用

论文摘要

热休克蛋白（Heat shock protein,HSPs）,又称应激蛋白,在各种生物中普遍存在,高度保守。按分子量不同,HSPs可以分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子家族。在正常生理条件下,HSPs正常表达,在新生蛋白折叠、转运等过程中发挥重要生理作用;当机体细胞受到各种应激时,HSPs表达含量会显著变化。近来研究表明,HSPs与肿瘤的发生与发展有着密切的相关性。在MDV引起鸡肿瘤的发生、发展过程中,HSP60表达量显著升高,且主要定位于肿瘤细胞的胞浆中,暗示着HSP60对肿瘤细胞的增殖发挥着重要生物学作用。而HSP60表达量高低对于肿瘤细胞凋亡的生物学作用未见报道。MDCC-MSB1细胞是MD成淋巴细胞样细胞系。本课题将MDCC-MSB1细胞作为研究对象,通过设计合成HSP60的siRNA干扰序列,构建siRNA慢病毒,抑制MDCC-MSB1内HSP60的转录和表达,利用荧光定量RT-PCR、Western Blot、流式细胞术等方法检测HSP60的转录、表达水平及MDCC-MSB1细胞凋亡情况,研究HSP60表达量与MDCC-MSB1细胞凋亡之间的相关性,阐述HSP60在肿瘤细胞增殖过程中的生物学作用。根据NCBI公布的鸡HSP60和GAPDH基因mRNA序列,利用Primer premier 5.0生物软件及参考文献,设计并合成6对引物,通过梯度普通PCR及梯度荧光定量PCR,对各引物扩增条件进行了优化。回收PCR扩增的基因片段,连接pUCm-T载体,转化DH5α感受态细胞,筛选、鉴定重组质粒,系列稀释作为阳性标准品,制作标准曲线。优化了鸡HSP60荧光定量RT-PCR方法,并对其扩增效率、敏感性、特异性进行了检测。结果证明,建立的荧光定量RT-PCR方法可以真实地反映反应管中模板初始数量,HSP60、GAPDH标准曲线斜率接近,扩增效率良好,可用于MDCC-MSB1细胞中HSP60和GAPDH基因mRNA水平的检测。根据NCBI公布的HSP60序列,设计3条RNA干扰序列,构建慢病毒,优化慢病毒转染MDCC-MSB1细胞的条件,利用荧光定量PCR、WesternBlot等技术,检测RNA干扰效果。结果表明,慢病毒浓度为1×108TU/mL,不添加助转染试剂,转染效率最佳,细胞状态良好;成功构建了MDCC-MSB1细胞HSP60 RNA干扰慢病毒。其中5147序列慢病毒干扰效果最佳,转染36 h时,转录水平、蛋白表达水平分别比对照序列慢病毒组下降88.6%和70.6%;转染48 h时,与空白对照组相比转录水平、蛋白表达水平分别比对照序列慢病毒组下降87.7%和75.9%。利用5147序列慢病毒转染MDCC-MSB1细胞,转染后48 h时,收集细胞,利用荧光定量PCR、Western Blot以及流式细胞技术,检测HSP60转录表达水平以及细胞凋亡水平。结果显示,5147序列慢病毒干扰48 h时,MDCC-MSB1细胞HSP60转录、表达水平分别降低81.1%和85.2%,细胞凋亡率提高46.9%。证明通过降低HSP60的表达水平,能够导致MDCC-MSB1细胞凋亡升高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 热休克蛋白研究进展
•   1 HSPs的概述
•     1.1 HSPs分类
•     1.2 HSPs细胞内定位
•     1.3 HSPs的生物学特性
•     1.4 HSPs的主要生物学功能
•   2 热休克蛋白60的结构与功能
•     2.1 HSP60基因及结构
•     2.2 HSP60与底物蛋白相互作用
•   3 HSP60与细胞凋亡
•   4 HSP60与肿瘤细胞的相关性
•     4.1 HSP60在肿瘤细胞中的水平变化
•     4.2 HSP60表达与肿瘤细胞增殖之间的相关性。
•     4.3 HSP60与肿瘤分化的相关性
•     4.4 HSP60与肿瘤细胞线粒体功能
•     4.5 HSP60和肿瘤细胞的代谢凋亡途径
•   5 HSP60调节肿瘤细胞的分子机制
•     5.1 HSP60与p53结合作用
•     5.2 HSP60维持survivin蛋白的稳定性
•     5.3 HSP60调节线粒体氧化磷酸化功能
•     5.4 HSP60与BcL-2家族相互作用
• 第二章 鸡HSP60荧光定量RT-PCR方法的优化
•   1 试验材料与方法
•     1.1 试验材料
•     1.2 试验方法
•   2 试验结果
•     2.1 普通RT-PCR反应条件优化
•     2.2 荧光定量PCR方法优化
•     2.3 荧光定量PCR标准曲线
•   3 小结
• 第三章 RNA干扰慢病毒构建及有效性检测
•   1 试验材料与方法
•     1.1 试验材料
•     1.2 试验方法
•   2 试验结果
•     2.1 慢病毒转染及条件优化
•     2.2 慢病毒转染干扰
•   3 小结
• 第四章 HSP60对MDCC-MSB1 细胞凋亡的影响
•   1 试验材料与方法
•     1.1 试验材料
•     1.2 试验方法
•   2 试验结果
•     2.1 荧光定量检测
•     2.2 Western BLot检测
•     2.3 细胞凋亡检测
•   3 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 段世豪

导师: 李玉保

关键词: 热休克蛋白,细胞,细胞凋亡,流式细胞,荧光定量

来源: 聊城大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 聊城大学

基金: 山东省自然科学基金项目,项目编号:ZR2016CM40

分类号: Q25

DOI: 10.27214/d.cnki.glcsu.2019.000134

总页数: 57

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