玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞线粒体DNA损伤及其机制的初步研究

论文摘要

线粒体是细胞内生成ATP最多的细胞器,也是体内ROS的重要生成场所,因此线粒体和线粒体DNA（mtDNA）可能处于高氧化胁迫环境中,很容易发生氧化损伤。哺乳动物线粒体的专一性来源于卵母细胞,卵母细胞内线粒体及mtDNA的损伤必然会影响到卵母细胞的成熟乃至整个受精卵发育的过程。为了探究玻璃化冷冻对小鼠mtDNA的损伤及其机制,本研究以小鼠卵母细胞作为材料,共分为三组,分别为新鲜对照组、冷冻液处理组和冷冻-复苏组。通过PCR、qPCR、Elisa等实验方法探究玻璃化冷冻对卵母细胞mtDNA拷贝数、3867bp（9089位点到12956位点）缺失、8-OHdG含量以及β-半乳糖苷酶活性的影响,结果如下:1、经荧光定量PCR检测各组卵母细胞mtDNA的CQ值,发现冷冻-复苏组卵母细胞mtDNA的CQ值（33.52±0.4419）,显著高于新鲜对照组（22.63±0.3404）和冷冻液处理组（24.35±0.1015）（P<0.05）。荧光定量CQ值越高,说明卵母细胞mtDNA拷贝数越低。结果表明冷冻-复苏导致卵母细胞mtDNA的拷贝数发生明显变化,显著低于新鲜对照组和冷冻液处理组。由此可见,玻璃化冷冻会使卵母细胞mtDNA的拷贝数显著减少。2、经半定量PCR法检测各组卵母细胞mtDNA3867bp片段的缺失情况,发现冷冻-复苏组经PCR扩增后,卵母细胞mtDNA产生了大量的3867bp片段缺失,在电泳图中有相关条带出现,而新鲜对照组和冷冻液处理组未有相关条带的出现。3、经Elisa法检测各组卵母细胞β-半乳糖苷酶的活性,发现冷冻-复苏组卵母细胞β-半乳糖苷酶吸光度（0.0529±0.0002）,显著低于新鲜对照组（0.0734±0.0006）和冷冻液处理组（0.0756±0.0007）（P<0.05）。β-半乳糖苷酶吸光度越低,说明其活性越高,结果表明冷冻-复苏导致卵母细胞β-半乳糖苷酶活性发生明显变化,显著高于新鲜对照组和冷冻液处理组。4、经Elisa法检测各组卵母细胞mtDNA的8-OHdG浓度变化,发现冷冻-复苏组卵母细胞mtDNA的8-OHdG浓度（0.1538±0.0987）,显著高于新鲜对照组（0.0339±0.0007）和冷冻液处理组（0.0642±0.0018）（P<0.05）,而冷冻液处理组卵母细胞mtDNA的8-OHdG浓度也显著高于新鲜对照组（P<0.05）。由此可见,玻璃化冷冻及冷冻保护液处理均会使卵母细胞8-OHdG浓度显著增加。结论:玻璃化冷冻会使小鼠卵母细胞线粒体DNA的拷贝数降低,3867bp片段缺失增多,mtDNA上8-OHdG浓度升高,β-半乳糖苷酶活性升高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写—中文对照表Ⅰ
• 英文缩写—中文对照表Ⅱ
• 第一章 前言
•   1.1 线粒体和线粒体DNA
•     1.1.1 卵母细胞发育过程中线粒体的重要性
•     1.1.2 卵母细胞中mtDNA拷贝数的变化
•   1.2 自由基与mtDNA损伤
•   1.3 卵母细胞和冷冻保存
•     1.3.1 冷冻保存原理
•     1.3.2 冷冻保存的发展
•     1.3.3 冷冻保护剂的比较分析
•     1.3.4 玻璃化冷冻技术
•     1.3.5 玻璃化冷冻的安全性
•     1.3.6 本研究的意义和目的
• 第二章 玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞线粒体DNA损伤的影响
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验方法
•     2.1.3 数据分析
•   2.2 实验结果
•     2.2.1 卵母细胞mtDNA浓度
•     2.2.2 玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞mtDNA拷贝数的影响
•     2.2.3 玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞mtDNA3867bp缺失的影响
•   2.3 讨论
• 第三章 玻璃化冷冻卵母细胞mtDNA损伤的机制探讨
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验方法
•   3.2 数据分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞内β-半乳糖苷酶活性的影响
•     3.3.2 玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞内8-OHdG含量的影响
•   3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张艺钟

导师: 王晓丽

关键词: 玻璃化冷冻,线粒体,拷贝数,片段,半乳糖苷酶,卵母细胞,小鼠

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学

基金: 国家自然科学基金项目(31101777,31460644)

分类号: Q492

总页数: 56

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