重组腐败梭菌α毒素突变体的生物学特性及免疫原性研究

论文摘要

腐败梭菌（Clostridium septicum）是人气性坏疽和动物恶性水肿的主要病原,也是羊快疫的病原,其产生的α毒素（Clostridium septicum alpha toxin,CSA）是其主要的致病因子和免疫原。由该菌引起的羊快疫发病急,往往来不及治疗发病动物即行死亡,因此疫苗免疫是预防该病的唯一有效措施。预防该病的疫苗均由腐败梭菌强毒培养物经甲醛灭活脱毒制成菌体-类毒素疫苗,由于生产过程中需要培养大量的强毒菌液,存在着一定生物安全隐患。因而,无毒重组腐败梭菌α毒素疫苗已成为新型疫苗的研制热点。本研究依据大肠杆菌偏爱的密码子,优化合成包含信号肽的腐败梭菌α毒素全基因并连接至pEZ-clone质粒,以该质粒为模板采用OEPR（Overlap Extension PCR and Recombination）法构建了表达CSA的重组质粒pET28a-csa,以pET28a-csa为模板,利用点突变技术,成功构建7个不同腐败梭菌α毒素突变体的表达载体(pET28a-csaC86L、pET28a-csaY118T、pET28a-csaTMD△212-222、pET28a-csaC86L/TMD△212-222、pET28a-csaY118T/TMD△212-222、pET28a-csaC86L/Y118T和pET28a-csaC86L/Y118T/TMD△212-222)并将其分别转化至大肠杆菌BL21,得到表达CSA和7个不同CSA突变体的重组菌。诱导表达及SDS-PAGE分析结果表明,8个重组蛋白的分子量与预期大小一致,均以包涵体和可溶性两种形式获得表达。8个重组蛋白的相对表达量分别为rCSAC86L86L 5.86%、rCSAY118T118T 6.56%、rCSATMD△212-22212-222 15.4%、rCSAC86L/TMD△212-22212-222 12.7%、rCSAY118T/TMD△212-22212-222 12.9%、rCSAC86L/Y118T4.26%、rCSAC86L/Y118T/TMD△212-22212-222 11.9%、rCSA 7.11%,结果表明跨膜区的缺失可增加蛋白表达量。Western-blotting结果表明,所有的重组蛋白均可被腐败梭菌α毒素高免血清识别,具有良好的反应原性。小鼠毒性试验表明,rCSA对小鼠的致死量为0.1μg/只,rCSAY118T为1μg/只,两者相比rCSAY118T对小鼠致死性下降10倍,表明CSA的Y118T突变,虽然降低了对小鼠的致死性,但并未完全消除其毒性,而rCSAC86L和rCSAC86L/Y118T18μg/只、rCSAY118T/TMD△212-22280μg/只、rCSATMD△212-222、rCSAC86L/TMD△212-222、rCSAC86L/Y118T/TMD△212-222 120μg/只均未致死小鼠,与rCSA相比,对小鼠的致死性分别至少下降了180、800和1200倍,表明这6个CSA突变体均已丧失了对小鼠的致死性。细胞试验表明,以rCSA 0.001μg/mL、rCSAY118T0.5μg/mL的浓度接种Vero细胞即可引起细胞病变,而rCSAC86L/Y118T86L/Y118T 1μg/mL、rCSAC86L和rCSAY118T/TMD△212-22212-222 10μg/mL、rCSAC86L/TMD△212-22212-222 30μg/mL、rCSATMD△212-222和rCSAC86L/Y118T/TMD△212-22212-222 50μg/mL的浓度接种Vero细胞,均不引起细胞病变,与rCSA相比,rCSA突变体对细胞的毒性至少分别下降了500、1000、10000、30000和50000倍,结果表明除rCSAY118T仍具有一定细胞毒性外,其余rCSA突变体均已丧失了细胞毒性,且细胞毒性试验与小鼠毒性试验结果一致。溶血试验表明,rCSA具有溶血活性,而7个rCSA突变体均丧失了溶血活性。将rCSA及7个不同的rCSA突变体可溶性表达产物制备成氢氧化铝胶疫苗,以200μg/只的剂量皮下注射家兔,间隔21天进行二免,在免疫前（D0）、一免后21天（D21）、一免后35天（D35）分别进行采血,并于D35以1MLD的腐败梭菌毒素进行攻毒。攻毒结果表明,除rCSAC86L/TMD△212-222免疫组（4/5）和rCSAY118T/TMD△212-222免疫组（2/4）外,其余各组均5/5保护。血清中和效价测定结果表明,一免后,rCSAC86L、rCSAY118T、rCSATMD△212-222、rCSAC86L/TMD△212-222、rCSAY118T/TMD△212-222、rCSAC86L/Y118T、rCSAC86L/Y118T/TMD△212-222、rCSA免疫组的血清中和效价（每0.1 mL的混合免疫血清可中和的腐败梭菌毒素小鼠MLD数）分别为3、7、2、2、1、2、4、10;二免血清的中和效价分别为20、36、34、20、2、60、24、60。该结果也表明CSA的第118位的Y及跨膜区不仅与毒素的毒力相关,也与毒素的免疫原性相关。综合7个rCSA突变体蛋白的表达量、对小鼠的毒性、细胞毒性、血清中和效价及免疫攻毒保护结果,选取重组菌E.coli BL21(pET28a-csaTMD△212-222)进行了rCSATMD△212-222表达条件的优化以提高其可溶性蛋白的表达量,并对纯化的rCSATMD△212-222的免疫原性进行了进一步的试验。结果表明,rCSATMD△212-222的最佳表达条件为在菌液OD600为0.8时,加入0.5 mM的IPTG,于15℃诱导16 h,可使可溶部分表达量最大,蛋白表达量可达24.7%。纯化的rCSATMD△212-222纯度可达85%,以140μg/只的剂量静脉注射,小鼠仍健活,以80μg/mL接种Vero细胞不引起细胞病变,表明rCSATMD△212-222已经丧失了小鼠致死毒性和细胞毒性。将纯化后的表达产物制备成氢氧化铝胶疫苗,按25μg/只、50μg/只和100μg/只的剂量皮下免疫家兔,间隔21天二免,在免疫前（D0）、一免后21天（D21）、一免后35天（D35）分别进行采血,并于D35以1 MLD的腐败梭菌毒素进行攻毒。一免后,25μg、50μg、100μg免疫组的血清中和效价为1、4和6;二免血清中和效价分别为68、72和58,二免后攻毒各组均5/5保护。综上所述,本研究构建的E.coli BL21(pET28a-csaTMD△212-222)菌株具有目的蛋白表达量高、表达产物无毒性、免疫原性好等特点,可作为重组腐败梭菌疫苗研制的候选菌株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 引言
•   1.1 腐败梭菌概述
•     1.1.1 病原学
•     1.1.2 致病性
•     1.1.3 临床症状和病理变化
•     1.1.4 诊断
•     1.1.5 免疫与防控
•   1.2 腐败梭菌α毒素的研究进展
•     1.2.1 α 毒素的一般特性
•     1.2.2 α 毒素的结构与功能
•     1.2.3 α 毒素的致病机理
•     1.2.4 α 毒素的免疫原性
•   1.3 本研究的目的与意义
• 第二章 重组腐败梭菌α毒素突变表达载体的构建
•   2.1 引言
•   2.2 材料
•     2.2.1 菌株、载体和细胞
•     2.2.2 主要试剂
•   2.3 方法
•     2.3.1 腐败梭菌α毒素基因的扩增
•     2.3.2 重组表达载体pET28a-csa的构建
•     2.3.3 不同重组腐败梭菌α毒素突变表达载体的构建
•   2.4 结果
•     2.4.1 腐败梭菌α毒素密码子的优化
•     2.4.2 腐败梭菌α毒素基因的扩增
•     2.4.3 重组表达载体pET28a-csa的构建
•     2.4.4 重组表达载体pET28a-csa的序列测定
•     2.4.5 不同重组腐败梭菌α毒素突变表达载体的构建
•     2.4.6 不同重组腐败梭菌α毒素突变表达载体的序列测定
•   2.5 讨论
•   2.6 小结
• 第三章 不同rCSA突变体的表达与生物活性鉴定
•   3.1 引言
•   3.2 材料
•     3.2.1 菌株、质粒和细胞
•     3.2.2 毒素、抗体与血清
•     3.2.3 主要试剂
•     3.2.4 实验动物
•   3.3 方法
•     3.3.1 重组α毒素及其突变体的诱导表达
•     3.3.2 重组α毒素及其突变体的生物特性研究
•   3.4 结果
•     3.4.1 重组菌的诱导表达
•     3.4.2 重组α毒素及其突变体的生物特性研究
•   3.5 讨论
•   3.6 小结
• 第四章 不同重组腐败梭菌α毒素突变体的免疫原性比较
•   4.1 引言
•   4.2 材料
•     4.2.1 菌株、毒素与抗体
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 实验动物
•   4.3 方法
•     4.3.1 不同重组α毒素突变体的制备
•     4.3.2 不同重组α毒素突变体的浓度测定
•     4.3.3 不同重组α毒素突变体疫苗的制备
•     4.3.4 不同重组α毒素突变体的免疫原性比较
•   4.4 结果
•     4.4.1 不同重组α毒素突变体的浓度测定
•     4.4.2 疫苗的检验
•     4.4.3 不同重组α毒素突变体的免疫原性比较
•   4.5 讨论
•   4.6 小结
• TMD△212-222表达条件优化、表达产物的生物活性及免疫原性'>第五章 rCSA_{TMD△212-222}表达条件优化、表达产物的生物活性及免疫原性
•   5.1 引言
•   5.2 材料
•     5.2.1 菌株、毒素与抗体
•     5.2.2 主要试剂
•     5.2.3 实验动物
•   5.3 方法
•     5.3.1 重组菌表达条件的优化
• TMD△212-222的纯化'>    5.3.2 重组蛋白rCSA_{TMD△212-222}的纯化
• TMD△212-222的生物活性鉴定'>    5.3.3 重组蛋白rCSA_{TMD△212-222}的生物活性鉴定
• TMD△212-222疫苗的制备'>    5.3.4 重组α毒素突变体rCSA_{TMD△212-222}疫苗的制备
• TMD△212-222疫苗免疫效果的比较'>    5.3.5 不同免疫剂量rCSA_{TMD△212-222}疫苗免疫效果的比较
•   5.4 结果
•     5.4.1 重组菌表达条件的优化
• TMD△212-222的纯化'>    5.4.2 重组蛋白rCSA_{TMD△212-222}的纯化
• TMD△212-222的生物活性鉴定'>    5.4.3 重组蛋白rCSA_{TMD△212-222}的生物活性鉴定
• TMD△212-222疫苗的制备'>    5.4.4 重组α毒素突变体rCSA_{TMD△212-222}疫苗的制备
• TMD△212-222疫苗的免疫效果比较'>    5.4.5 不同免疫剂量rCSA_{TMD△212-222}疫苗的免疫效果比较
•   5.5 讨论
•   5.6 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录1 pET-28a-c（+）载体
• 附录2 OEPR法构建重组质粒示意图
• 附录3 试验用主要溶液和培养基的配制
• 附录4 试验用主要仪器和设备
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董令赢

导师: 蒋玉文

关键词: 腐败梭菌,毒素,突变体,免疫原性,纯化

来源: 中国兽医药品监察所

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国兽医药品监察所

基金: 国家重点研发计划编号:2017YFD0500905

分类号: S852.61

总页数: 82

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