猪伪狂犬病毒HNJY的分离鉴定及其生物学特性分析

论文摘要

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起多种家畜和野生动物的一种急性、热性传染病,主要临床症状为发热、奇痒、急性脑脊髓炎和繁殖障碍。从2011年底开始,我国规模化猪伪狂犬病免疫猪场突然暴发猪伪狂犬病疫情。2018年1月,河南省济源市某规模化PRV免疫猪场发生疑似猪伪狂犬病症状的疫情,本试验通过采集病料经PCR鉴定,对疑似PR的病料接种至PK-15进行病原分离、空斑纯化、病毒滴度测定、病毒生长曲线测定和病毒致病力测定试验;对PRV分离株gE、gB、gC、gD和TK基因进行PCR扩增并测序,并对其序列进行分析比对,以及构建遗传进化树进行分析。通过对来自河南省济源市某猪场的疑似PR感染的病料进行PRV gE鉴定,初步确定PRV野毒感染;病料经研磨、除菌处理后接种至PK-15细胞,接种24-48h内PK-15细胞在显微镜下可观察到细胞变圆、脱落,培养基变浑浊等明显病变;再经空斑纯化,获得一株PRV野毒株,并命名为HNJY株。PRV分离株HNJY株TCID50为10-8.7/0.1 mL,小鼠致病性试验结果显示:将HNJY株病毒接种至小鼠后,小鼠出现奇痒症状并死亡,LD50的结果为10531 TCID50.HNJY株gE、gB、gC、gD和TK基因与国内外参考毒株进行序列比对,结果显示:HNJY株gE、gB、gC、gD基因与国内毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别高达 99.2%-99.9%和98.6%-100%、99.7%-100.0%和 99.2%-100.0%、96.9%-100%和94.6%1 00%、99.4%-99.9%和99.3%-99.8%,且高于欧美毒株;gB、gC基因与201 1年之后分离的国内变异株的核苷酸和氨酸同源性分别高达99.9%-1 00%和99.8%-100%、99.8%-100.0%和99.4%-1 00.0%,且高于2011年之前国内分离株和欧美毒株;TK基因与所有国内外毒株的核甘酸合氨基酸同源性高达99.4%-100%,表明TK基因高度保守。氨基酸进化树结果显示:gE、gB基因氨基酸进化树分为欧美毒株和国内毒株两大分支,HNJY株与国内毒株在同一分支:gC基因氨基酸进化树与毒株分离年代有明显关联,HNJY株与2011年之后分离的国内变异株在同一小分支上;gD、TK难因与所有国内变异株在同一分支上。HNJY株gD基因与国内外参考毒株进行氨基酸序列比对,在256位由丙氨酸突变为苏氨酸,进一步说明本试验分离株HNJY株属于一株独立的国内变异株。

论文目录

• 致谢
• 英文缩略表
• 摘要
• 第一章 文章综述
•   1.1 猪伪狂犬病的流行现状
•     1.1.1 猪伪狂犬病简述
•     1.1.2 PR国外流行史
•     1.1.3 PR国内流行史
•   1.2 PRV结构与主要基因介绍
•     1.2.1 PRV粒子结构
•     1.2.2 PRV基因组
•     1.2.3 PRV主要基因的功能
•       1.2.3.1 gE基因
•       1.2.3.2 gB基因
•       1.2.3.3 gC基因
•       1.2.3.4 gD基因
•       1.2.3.5 TK基因
•   1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 猪伪狂犬病毒河南省HNJY株的分离鉴定
•   2.1 材料
•     2.1.1 病料、阳性毒株及细胞来源
•     2.1.2 试验动物
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 主要试剂及溶液配制
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 病料样品的采集与处理
•     2.2.2 病原的PCR鉴定
•       2.2.2.1 引物信息
•       2.2.2.2 病毒总核酸的提取
•       2.2.2.3 RNA的反转录
•       2.2.2.4 反应体系及PCR扩增程序
•     2.2.3 病毒的分离
•       2.2.3.1 细胞复苏
•       2.2.3.2 细胞传代
•       2.2.3.3 细胞冻存
•       2.2.3.4 细胞接毒
•     2.2.4 空斑纯化
• 50)的测定'>    2.2.5 PRV分离株组织细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定
•     2.2.6 PRV分离株一步生长曲线的测定
•     2.2.7 PRV分离株对BALB/c小鼠致病性试验
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 病料的PCR鉴定
•     2.3.2 病毒的分离
•     2.3.3 分离病毒的空斑纯化
•     2.3.4 分离毒株滴度的测定
•     2.3.5 分离毒株一步生长曲线的测定
•     2.3.6 分离毒株对小鼠致病性试验
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 HNJY株主要基因的克隆及序列分析
•   3.1 材料
•     3.1.1 毒株、菌株、载体
•     3.1.2 主要仪器
•     3.1.3 主要试剂及培养基的配制
•     3.1.4 制备感受态细胞
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 引物设计及合成
•     3.2.2 基因组DNA的提取
•     3.2.3 目的基因片段的扩增
•     3.2.4 目的产物的纯化回收
•     3.2.5 目的产物与载体的连接
•     3.2.6 连接产物的转化
•     3.2.7 质粒的提取
•     3.2.8 重组质粒的双酶切鉴定
•     3.2.9 阳性质粒的测序及序列分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 gE、gB、gC、gD及TK基因全长扩增
•       3.3.1.1 gE基因全长扩增
•       3.3.1.2 gB基因全长扩增
•       3.3.1.3 gC基因全长扩增
•       3.3.1.4 gD基因全长扩增
•       3.3.1.5 TK基因全长扩增
•     3.3.2 gE、gB、gC、gD、TK基因重组质粒的双酶切鉴定
•     3.3.3 gE基因同源性比对及遗传进化分析
•       3.3.3.1 gE基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对
•       3.3.3.2 gE基因氨基酸序列分析
•       3.3.3.3 gE基因氨基酸进化树分析
•     3.3.4 gB基因同源性比对及遗传进化分析
•       3.3.4.1 gB基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对
•       3.3.4.2 gB基因氨基酸序列分析
•       3.3.4.3 gB基因氨基酸进化树分析
•     3.3.5 gC基因同源性比对及遗传进化分析
•       3.3.5.1 gC基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对
•       3.3.5.2 gC基因氨基酸序列分析
•       3.3.5.3 gC基因氨基酸进化树分析
•     3.3.6 gD基因同源性比对及遗传进化分析
•       3.3.6.1 gD基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对
•       3.3.6.2 gD基因氨基酸序列分析
•       3.3.6.3 gD基因氨基酸进化树分析
•     3.3.7 TK基因同源性比对及遗传进化分析
•       3.3.7.1 TK基因核苷酸及氨基酸序列同源性比对
•       3.3.7.2 TK基因氨基酸进化树分析
•   3.4 讨论
•     3.4.1 PRV gE基因序列分析
•     3.4.2 PRV gB基因序列分析
•     3.4.3 PRV gC基因序列分析
•     3.4.4 PRV gD基因序列分析
•     3.4.5 PRV TK基因序列分析
•   3.5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张中华

导师: 李文刚

关键词: 猪伪狂犬病,分离鉴定,生物学特性

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000423

总页数: 71

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