羊口疮病毒编码的锚蛋白抑制NF-κB信号通路的分子机制研究

论文摘要

目的:羊传染性脓疱（CE）是由山羊或绵羊感染羊口疮病毒（ORFV）而引起的一种急性、高度接触性传染病,同时该病毒可感染人类,引起高传染性的人畜共患病。ORFV是痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科副痘病毒属的主要成员。大多数的痘病毒为保证自身在宿主细胞中的正常复制,针对NF-κB信号通路进化出了独特的调节宿主免疫应答的能力。由多拷贝的锚蛋白重复（ANK）基序组成的锚蛋白,作为痘病毒蛋白中最大的家族,在病毒逃避宿主免疫应答中发挥重要作用。目前关于痘病毒锚蛋白调节宿主NF-κB信号通路的研究已有很多,但有关副痘病毒属锚蛋白与NF-κB信号通路互作关系的研究却较少。本研究为系统探讨副痘病毒属ORFV编码的五种锚蛋白ORF008、ORF123、ORF126、ORF128、ORF129对NF-κB信号通路的调节作用机制,首先验证ORFV编码的五种锚蛋白是否可在293T细胞中正确表达,并探讨锚蛋白对宿主细胞核因子κB（NF-κB）信号通路的调节作用;其次研究ORFV编码的锚蛋白ORF128蛋白调节宿主NF-κB信号通路的作用机制;同时,初步构建ORFV-?ORF123重组病毒,为进一步深入研究ORFV编码锚蛋白在病毒中的生物学功能奠定基础。方法:1.利用Western-blot法检测构建在pCMV-tag2B真核表达载体上的ORFV锚蛋白在293T细胞中的表达情况;利用双荧光素酶报告系统检测分析ORFV锚蛋白对NF-κB信号通路的调节作用。2.利用Western-blot法检测ORF128的表达对NF-κB-p65的核移位以及NF-κB抑制蛋白α（IκBα）的蛋白磷酸化水平的影响。3.构建针对ORFV毒株ORF123蛋白缺失的pSP72-ORF123LR重组质粒及携带EGFP标记基因和gpt抗性基因的pORF123LR-Eg转移载体,pORF123LR-Eg转移载体与ORFV基因组之间的同源重组在绵羊睾丸细胞（Ovine testis cell,OT）中进行,以EGFP为筛选标记在荧光显微镜下筛选重组缺失病毒ORFV?ORF123。结果:1.通过Western-blot法验证,构建在真核表达载体pCMV-tag2B上的锚蛋白重组质粒均可在293T细胞中正确表达。在五种锚蛋白上样量一致（均为20μg）的条件下,ORF123在293T细胞中的蛋白表达量最多,ORF128次之;五种锚蛋白均可抑制NF-κB报告载体荧光素酶活性,其中,ORF123的抑制作用最为显著,ORF128次之,且这种抑制作用呈剂量依赖性。2.Western-blot检测结果显示与pCMV-tag2B空载对照组相比,ORF128转染组中NF-κB-p65蛋白的核位移明显受到抑制;检测其上游的NF-κB-p65蛋白抑制剂IκBα的磷酸化水平发现,随着TNF-α刺激时间的增加,ORF128转染组中IκBα的磷酸化并未受到影响,而p-IκBα的降解则受到了明显的抑制。3.双酶切鉴定和测序结果均表明,正确构建pSP72-ORF123LR重组质粒和pORF123LR-Eg转移载体;荧光显微镜观察结果显示,与空白对照组、单独接毒对照组以及单独转染转移载体对照组相比,只有在接毒两小时后转染转移载体的实验组可观察到重组到病毒基因组上的转移载体所发出的绿色荧光。结论:1.ORFV的五种锚蛋白可在真核细胞中正确表达并抑制宿主细胞NF-κB信号通路。2.ORF128蛋白通过抑制p-IκBα蛋白的降解过程,阻止NF-κB-p65蛋白核转位,进而抑制宿主NF-κB信号通路的活化。3.ORFV-?ORF123重组病毒的初步构建,为进一步筛选并获得稳定遗传的ORFV-?ORF123重组病毒奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词英汉对照表
• 第一章 前言
•   1.1 人兽共患病
•   1.2 羊口疮
•     1.2.1 羊口疮的流行现状
•     1.2.2 羊口疮的临床特征与诊断
•   1.3 羊口疮病毒（ORFV）
•     1.3.1 ORFV基因组学研究
•     1.3.2 ORFV的毒力因子和致病机制
•   1.4 锚蛋白
•     1.4.1 痘病毒编码的锚蛋白
•     1.4.2 痘病毒锚蛋白的功能
•     1.4.3 ORFV编码的锚蛋白及其作用
•   1.5 NF-κB信号通路
•   1.6 痘病毒编码的锚蛋白与NF-κB信号通路的相互作用
•   1.7 本研究的目的意义
• 第二章 ORFV编码的锚蛋白对NF-κB信号通路调节作用
•   2.1 材料
•     2.1.1 细胞与质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•   2.2 方法
•     2.2.1 主要试剂的配制
•     2.2.2 293T细胞的培养
•     2.2.3 Western-blot验证锚蛋白在真核细胞中的表达
•     2.2.4 NF-κB荧光素酶活性的检测
•     2.2.5 统计学分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 Western-blot验证ORFV编码的五种锚蛋白在真核细胞中的表达
•     2.3.2 五种锚蛋白对NF-κB相对荧光素酶活性的调节作用
•     2.3.3 不同浓度的锚蛋白对NF-κB相对荧光素酶活性的影响
•   2.4 讨论
• 第三章 ORF128 调节NF-κB信号通路的机制研究
•   3.1 材料
•     3.1.1 细胞、毒株与质粒
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 NF-κB-p65入核的检测
•     3.2.2 IκBα蛋白磷酸化的检测
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 ORF128基因序列的生物信息学分析
•     3.3.2 ORF128蛋白影响NF-κB-p65核位移
•     3.3.3 ORF128蛋白对IκBα磷酸化的调节
•   3.4 讨论
• 第四章 ORFV ORF123缺失重组病毒的初步构建
•   4.1 材料
•     4.1.1 细胞、毒株与质粒
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 主要试剂的配制
•     4.2.2 ORFV-ΔORF123重组病毒构建引物设计
•     4.2.3 ORF123-L、ORF123-R左右同源臂的PCR扩增
•     4.2.4 ORF123左右同源臂的融合
•     4.2.5 pSP72-ORF123LR重组质粒的构建
•     4.2.6 pORF123LR-Eg转移载体的构建
•     4.2.7 OT细胞的培养
•     4.2.8 OT细胞对ORFV/QH02/2010毒株的敏感性验证
•     4.2.9 ORFV-ΔORF123重组病毒的初步构建
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 左右同源臂的PCR扩增和鉴定
•     4.3.2 左右同源臂的融合结果
•     4.3.3 pSP72-ORF123LR重组质粒的构建
•     4.3.4 pORF123LR-Eg转移载体的构建
•     4.3.5 OT细胞对ORFV/QH02/2010毒株的敏感性验证
•     4.3.6 ORFV-ΔORF123重组病毒的初步构建
•   4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 安雪珂

导师: 王晓霞,景志忠

关键词: 羊口疮病毒,锚蛋白,核因子信号通路

来源: 兰州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 兰州大学

分类号: S852.65

总页数: 59

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