犬瘟热病毒适应人SLAM受体的研究及犬瘟热灭活疫苗免疫效果评价

论文摘要

犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种多种属动物共患传染病,因其引起感染动物发病率高和死亡率高被人们所重视。CD临床症状多样,可以引起发热、结膜炎、神经系统症状等,病程中后期可因细菌引起继发感染。传统宿主包括犬科、鼬科、浣熊科和猫科等。近年来,CD在世界范围内暴发,特别是CD的跨宿主传播引起了人们的重视。作为CDV受体识别蛋白的H蛋白是病毒变异最频繁的蛋白,H蛋白变异导致的抗原漂移可能是CD高发的原因。研究显示,CDV H基因的变异导致病毒适应了新宿主猕猴,有可能突破宿主屏障通过SLAM受体传播给人类,这可能对当今人类公共卫生安全构成威胁。本研究通过表达绿色荧光蛋白（eGFP）的重组CDV 5804Pe株在表达人SLAM受体的Vero细胞（Vero-hSLAM,VHS）上连续传代,最终获得能快速适应人SLAM受体的毒株。病毒H基因测序表明,CDV适应人SLAM受体H基因第540位氨基酸发生改变,即由天冬氨酸（D）突变为甘氨酸（G）。通过构建突变体的真核表达载体和细胞融合试验证实,仅需一个氨基酸的改变就可以使CDV适应人SLAM。本研究通过对适应人SLAM受体的CDV 5804Pe毒株（5804Pe-VHS）进行全基因组测序,发现共有3处氨基酸位点发生突变。CDV不仅有感染新宿主的风险,对传统宿主的免疫防控也提出了新的挑战。CDV是犬的主要病原体,对自然犬群的致死率高达80%,幼龄犬最易感染。目前,接种疫苗被认为是预防犬瘟热最安全有效的方法。传统犬瘟热活疫苗研制于上世纪50-60年代,对全世界犬瘟热的防控作出了巨大贡献。然而部分犬瘟热活疫苗对野生动物（大熊猫、小熊猫、雪貂等）和幼犬仍然具有残余毒力,疫苗安全性不高。其次,伴随当前CDV的频繁变异,传统活疫苗对动物的免疫保护效果也提出质疑。因此,有必要通过研制新型安全高效疫苗（包括弱毒疫苗）,以保持犬瘟热疫苗良好的免疫保护效果。免疫佐剂是灭活疫苗的重要组成部分,能够提高灭活疫苗的免疫原性,并诱导宿主产生长期高水平的免疫应答,增强免疫效果,因此犬瘟热灭活疫苗是当前研究热点之一。本研究将CDV野毒株(106.0TCID50/mL)经β-丙内酯灭活后,通过添加不同疫苗佐剂制备成灭活疫苗,对幼龄比格犬进行3次免疫,免疫后的比格犬使用CDV强毒株攻毒,通过中和抗体测定、临床症状观察、采集口鼻和直肠拭子和组织脏器检测病毒载量等综合评估MONTANIDE GEL 02、ADJ-801和Al（OH）3三种佐剂制作的灭活疫苗的免疫效果。结果证实发现MONTANIDE GEL 02和ADJ-801佐剂制成的灭活疫苗能够显著增强CDV疫苗在比格犬体内的免疫应答,第三次免疫后中和抗体滴度分别为10.6和40.2,攻毒第14天中和抗体滴度均达512,保护率分别为80%和100%,具有良好的免疫效果,试验为CDV的防控提供了研究素材。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 犬瘟热病毒研究进展
•   1.1 犬瘟热病毒基因组
•     1.1.1 核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein N）
•     1.1.2 磷蛋白（Phospho protein P）
•     1.1.3 基质蛋白（Matrix protein M）
•     1.1.4 大蛋白（Large polymerase protein L）
•     1.1.5 融合蛋白（Fusion protein F）
•     1.1.6 附着蛋白或血凝素蛋白（Hemagglutinin protein H）
•   1.2 CDV的变异与跨宿主传播
•   1.3 犬瘟热的临床症状和病理变化
•   1.4 犬瘟热的流行病学
•   1.5 犬瘟热疫苗的研究现状
•     1.5.1 灭活疫苗
•     1.5.2 弱毒活疫苗
•     1.5.3 亚单位疫苗
•     1.5.4 DNA疫苗
•   1.6 研究的目的及意义
• 第二章 犬瘟热病毒适应人SLAM受体的研究
•   2.1 材料
•     2.1.1 病毒和细胞
•     2.1.2 载体与菌种
•     2.1.3 工具酶与主要试剂
•     2.1.4 主要仪器设备
•   2.2 方法
•     2.2.1 CDV5804Pe-VHS适应株的获得
•     2.2.2 CDV5804Pe-VHS适应株H基因RBS区分析
•     2.2.3 H基因真核表达载体的构建
•     2.2.4 H/F质粒共转染
•     2.2.5 CDV5804Pe-VHS适应株全基因组测序
•   2.3 结果及分析
•     2.3.1 CDV5804Pe株感染Vero-hSLAM细胞
•     2.3.2 CDV5804Pe株和5804Pe-VHS株对不同易感细胞的感染能力
•     2.3.3 5804 Pe-VHS H基因RBS区测序比对
•     2.3.4 H和 F基因PCR扩增
•     2.3.5 H和 F基因重组质粒鉴定
•     2.3.6 细胞融合
•     2.3.7 5804 Pe-VHS全基因组RT-PCR电泳结果
•     2.3.8 阳性重组克隆PCR鉴定结果
•     2.3.9 全基因组序列分析
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 犬瘟热灭活疫苗制备与免疫效果评价
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 试验动物与病毒
•     3.1.2 试验材料
•     3.1.3 主要仪器设备
•     3.1.4 灭活疫苗的制备
•     3.1.5 比格犬免疫
•     3.1.6 动物攻毒与病料采集
•     3.1.7 中和抗体的测定
•     3.1.8 淋巴细胞计数
•     3.1.9 病料处理及病理学观察
•     3.1.10 病毒RNA的提取和c DNA的合成
•     3.1.11 荧光定量PCR测定病毒RNA载量
•     3.1.12 统计学分析
•   3.2 结果及分析
•     3.2.1 CDV攻毒后临床症状
•     3.2.2 CDV攻毒后病理变化
•     3.2.3 CDV外周血淋巴细胞数
•     3.2.4 CDV中和抗体的测定
•     3.2.5 眼鼻拭子和直肠拭子中CDV RNA含量
•     3.2.6 组织脏器中CDV RNA含量
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘梦佳

导师: 王承宝,赵建军

关键词: 犬瘟热病毒,受体,灭活疫苗

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

分类号: S852.4

总页数: 61

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