导读:本文包含了前脑啡肽原基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:慢病毒载体,人前脑啡肽基因,HEK293细胞,基因表达
前脑啡肽原基因论文文献综述
白凤[1]（2014）在《慢病毒介导的人前脑啡肽原基因在HEK293细胞中的表达》一文中研究指出研究目的：构建含人前脑啡肽原基因(hPPE)的重组慢病毒载体,使其转染人胚胎肾细胞(HEK293),获得高效、稳定表达目的基因的细胞株并鉴定hPPE基因的表达情况。为后续转染人前脑啡肽原基因的HEK293细胞用于大鼠癌痛模型的生物镇痛研究提供实验材料。并为日后继续探讨内源性脑啡肽对慢性疼痛及癌性疼痛的治疗实验研究做好平台基础工作。研究方法：将本实验小组构建保存的重组质粒pcDNA3.1/hPPE经限制性内切酶Hind III,Not I剪切后获得hPPE基因片段,根据GenBank数据库中记载的hPPE基因序列设计均含有EcoR I酶切位点的上下游引物,通过PCR技术对目的基因进行扩增。用限制性内切酶EcoR I对表达载体(pLV-UbC-GFP-3FLAG)进行酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收线性化的载体。将扩增的目的基因片段与线性化的表达载体,通过运用基因重组技术进行连接,转化大肠杆菌(E.coli)感受态细胞,鉴定转化子,接种阳性克隆,保存并送测序。测序结果无误的,进行接种抽提目的基因表达质粒。将含有目的基因的表达载体(pLV-UbC-hPPE-GFP), pCD包装质粒,pLTR-G膜蛋白表达质粒共同转染HEK293细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞。用Western blot免疫印迹法检测hPPE基因在转染后的HEK293细胞中的蛋白表达情况。研究结果：1.目的基因(hPPE) PCR扩增后得到DNA产物大小为838bp,经琼脂糖凝胶电泳可显示清晰明亮的条带。纯化的目的基因片段与线性化的表达载体进行连接,转化,菌落PCR鉴定,阳性克隆测序,结果表明：和GenBank数据库中记录的hPPE基因序列比对结果完全一致,说明成功构建了重组慢病毒表达载体。2.重组目的基因表达载体和空表达载体分别与pCD包装质粒,pLTR-G膜蛋白表达质粒共同转染HEK293细胞,转染后第二日可见所有细胞健康且密度接近60%-80%。经慢病毒的包装、纯化后,根据病毒滴度公式计算得到病毒滴度为3.39×108TU/ml。3.HEK293细胞感染UbC-hPPE-GFP-L.V.后,在荧光显微镜下未见到GFP荧光。HEK293细胞感染Ubc-GFP-L.V.空病毒后,可以看出细胞发出较强的荧光,感染率通过观察荧光显微镜下细胞中显现出绿色荧光蛋白的阳性率来表示,可达到100%。4.通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测转染后的HEK293细胞样品以及传代至第15代的HEK293细胞样品,均可以观察到阳性条带位于略大于55KDa处有,其大小和hPPE-GFP-FLag融合蛋白(29KDa+28KDa+2KDa=59KDa)相吻合,可以判断hPPE在HEK293细胞中稳定表达。研究结论：本研究成功构建了含有hPPE基因的重组慢病毒载体,使hPPE基因可以稳定表达于HEK293细胞中,为进一步关于脑啡肽物质在疼痛治疗中的应用研究奠定了基础。(本文来源于《山西医科大学》期刊2014-05-23）
逄坤芳,陈鹤翔,杨辉,卜慧莲,刘希江[2]（2012）在《大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定》一文中研究指出目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。(本文来源于《华中科技大学学报(医学版)》期刊2012年03期）
李静,杨保仲,王维,洛珉,聂丽霞[3]（2010）在《pcDNA3.1(+)/人前脑啡肽原基因真核表达载体的构建》一文中研究指出目前慢性疼痛及癌症晚期疼痛的治疗方法仍主要依靠叁阶梯药物疗法,叁阶梯药物中以外源性镇痛药吗啡为主,其不良反应大,成瘾性高,限制了其大量使用,因此研究新的镇痛药及新的镇痛方法成为最近研究的热点。20世纪50年代以来,人们着力于研究新的镇痛物质,之后内源性镇痛物质[1]的发现及基因克隆技术[2]的应用为开辟新的镇痛研究奠定了基础。(本文来源于《中国药物与临床》期刊2010年10期）
曹靖,赵青赞,任秀花,张华,臧卫东[4]（2009）在《NIH3T3细胞中前脑啡肽原基因的稳定表达》一文中研究指出目的:利用重组逆转录病毒载体pLNCX2-pENK,研究pENK基因在NIH3T3细胞中是否能够稳定表达。方法:用pLNCX2-pENK转染病毒包装细胞PT67,其病毒上清液感染NIH3T3细胞,检测pENK基因是否整合入NIH3T3细胞基因组中并通过RT-PCR及放射免疫法检测基因表达情况。结果:病毒基因组整合到NIH3T3细胞基因组中,并检测到目的基因转录及蛋白表达。结论:用逆转录病毒载体能将pENK基因整合到靶细胞NIH3T3基因组中,且该基因能长期稳定表达,为慢性疼痛的进一步治疗奠定了基础。(本文来源于《郑州大学学报(医学版)》期刊2009年03期）
邹望远,杨勇,郭曲练,王锷,李准民[5]（2008）在《中脑导水管周围灰质立体定向注射单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体介导人前脑啡肽原基因对甲醛炎性痛大鼠的镇痛效应》一文中研究指出目的:观察中脑导水管周围灰质(PAG)立体定向注射介导人前脑啡肽原基因(HPPE)的单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)扩增子载体对甲醛炎性痛大鼠的镇痛效应。方法:成年雄性SD大鼠随机分为pHSVIRES-HPPE-LacZ载体SHPZ组,pHSVIRES-LacZ空白载体SHZ组和生理盐水NS组(n=51)。3组大鼠PAG立体定向注射SHPZ,SHZ和NS后于第3天、1周、2周、3周、4周、5周和6周时进行福尔马林实验观察镇痛效应。对注射后1周组(每组取9只)进行福尔马林实验后处死大鼠取出PAG标本观察HPPE转染表达情况,通过X-gal染色原位检测报告基因LacZ的表达,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测HPPEmRNA的表达,放射免疫法检测PAG组织中L-脑啡肽(L-EK)浓度。结果:PAG立体定向注射SHPZ后,X-gal原位染色、RT-PCR和放射免疫法检测均显示外源HPPE能有效表达。对甲醛诱发的炎性疼痛中,疼痛加权评分(PIS)于第1周、2周、3周、4周、5周时在第1相和第2相与空白载体对照组或生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),于第6周时第2相PIS与空白载体对照组或生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),对甲醛的镇痛效应可被腹腔注射纳洛酮拮抗。结论:SHPZ能成功地将外源HPPE基因转染到PAG神经元细胞中,并使之有效表达,HPPE的表达产物对甲醛炎性痛大鼠产生镇痛效应。(本文来源于《中南大学学报(医学版)》期刊2008年06期）
刘惠宁,邹望远,杨勇,王锷,李准民[6]（2006）在《大鼠鞘内注射单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体介导人前脑啡肽原基因的表达及对甲醛炎性痛的镇痛效应》一文中研究指出目的:大鼠鞘内注射介导人前脑啡肽原基因(HPPE)单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)扩增子载体,观察LacZ和HPPE在脊髓神经元细胞中的共表达及对甲醛炎性痛的镇痛效应。方法:纯种雄性SD大鼠随机分为pHSVIRES-HPPE-LacZ载体组(SHPZ),pHSVIRES-LacZ空白载体组(SHZ),生理盐水组(NS),又分为分别注射SHPZ,SHZ和NS后3d,1周,2周,3周,4周,5周时观察镇痛效应组,并对1周组观察HPPE转染表达,每组6只。采用改良Yaksh法对大鼠进行鞘内置管后,将构建好的含HPPE的重组单纯疱疹病毒I型扩增子载体注入大鼠鞘内,通过X-gal染色原位检测报告基因LacZ的表达,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测HPPE的表达,放射免疫法检测脊髓组织脑啡肽浓度,并观察转染含HPPE基因载体对大鼠甲醛炎性疼痛的镇痛效应。结果:pHSVIRES-HPPE-LacZ在体感染大鼠中枢神经细胞后,用X-gal染色、RT-PCR和放射免疫检测方法均证实外源脑啡肽基因能有效表达。对甲醛诱发的炎性疼痛中,疼痛加权评分(PIS)于1周,2周,3周,4周时在第1相和第2相与对照组比较有显着差异,于第5周时第2相PIS接近对照组,对甲醛的镇痛效应可被鞘内注射纳洛酮拮抗。结论:SHPZ能成功地将外源HPPE转染到脊髓神经元细胞中,使之有效表达,提示扩增子载体SHPZ是良好的慢性疼痛转基因治疗工具;HPPE的表达产物可对甲醛炎性痛产生镇痛效应。(本文来源于《中南大学学报(医学版)》期刊2006年05期）
邹望远,郭曲练,杨勇,王锷,李准民[7]（2006）在《大鼠鞘内注射含人前脑啡肽原基因单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的镇痛效应》一文中研究指出目的大鼠鞘内注射含人前脑啡肽原基因(HPPE)单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)扩增子载体的镇痛效应。方法60只纯种雄性SD大鼠,采用改良Yaksh法进行鞘内置管后,随机分为生理盐水组(NS组,n=18)、空白载体pHSVIRES-LacZ组(SHZ组,n=18)、重组HSV-Ⅰ扩增子载体pHSVIRES-HPPE-LacZ组(SHPZ组,n=24),大鼠鞘内分别注射生理盐水、SHZ、SHPZ,1周后分别从NS组、SHZ组和SHPZ组中取11只、11只、16只大鼠,取脊髓组织,用X-gal染色原位法测定LacZ的表达,用RT-PCR方法测定HPPE mRNA的表达,用放免法测定L-脑啡肽(L-EK)含量,并测定注射SHPZ后3d、1周、2周、3周、4周、5周时热痛阈(用后爪缩腿潜伏期表示)。结果在体转染大鼠中枢神经细胞,外源脑啡肽基因能有效表达。与基础值比较,SHPZ组注射SHPZ后1～4周时热痛阈升高,于注射SHPZ后3周时达到高峰(P＜0．05)；与NS组及SHZ组比较,SHPZ组于注射SHPZ后1～4周时热痛阈升高(P＜0．05),注射SHPZ后1周时脊髓组织L-EK含量升高。结论大鼠鞘内注射SHPZ有明显的镇痛效应。(本文来源于《中华麻醉学杂志》期刊2006年09期）
臧卫东[8]（2006）在《APA微囊化转前脑啡肽原基因细胞移植镇痛的实验研究》一文中研究指出疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的主观感觉和情感体验，它提供躯体受到威胁的警报信号，是不可缺少的生命保护功能，许多疾病和创伤都伴随有疼痛存在。疼痛在临床上是一个难题，特别是慢性顽固性疼痛，不仅给患者带来躯体和精神上的痛苦，也给家庭和社会带来沉重的负担。目前对慢性顽固性疼痛缺乏有效的治疗手段，因此寻找有效的治疗新方法是疼痛研究领域的前沿课题之一。 目前缓解疼痛的主要治疗药物仍是阿片类药物，但是它们所引起的诸多副作用，如过度镇静、呼吸抑制、便秘以及成瘾等，限制了这类药物的使用。寻找更方便、有效、作用持久且经济、安全的镇痛方法，成为人们关注的课题。 上世纪80年代后期，美国学者提出的细胞镇痛方法是慢性疼痛治疗领域的突破性进展。它是将一些特殊细胞植入到受者的中枢神经系统，通过细胞分泌神经活性物质而缓解疼痛或提高痛阈。存活的细胞如同一个生物泵，可持续分泌神经活性物质。目前，细胞移植多采用牛肾上腺髓质嗜铬细胞，但存在细胞原代培养困难，机体出现排异反应及细胞不能长期存活等缺点。为了能解决好上述问题，人们把目光投向转基因镇痛。 随着人们从细胞凋亡、细胞周期、细胞信号转导和反义核酸等角度对基因治疗研究的深人，以及逐步建立起安全有效的基因调控体系后，基因治疗将可能成为处理慢性疼痛的一种更为有效和安全的治疗手段。基因工程细胞移植，即利用(本文来源于《郑州大学》期刊2006-05-25）
曹靖[9]（2006）在《人前脑啡肽原基因逆转录病毒载体的构建及其表达》一文中研究指出慢性疼痛，尤其是癌性疼痛和顽固性疼痛一直是医疗界的一道难题。传统的镇痛药尚不能有效治疗慢性疼痛尤其癌痛。脑啡肽作为一种内源性阿片肽类镇痛药受到关注，用于许多动物实验已证明有明显的镇痛效应。将前脑啡肽原基因做为目的基因，利用逆病毒载体，经过包装细胞系的包装，产生的病毒可将前脑啡肽原基因整合到靶细胞NIH3T3细胞的基因组中，制造出可以分泌镇痛物质脑啡肽的工程化细胞系，利用人工大量获得。本实验采用pLNCX2载体，其中5′LTR(包括病毒启动子／增强序列)可控制neo~r基因的表达，用于真核细胞中抗生素筛选。目的基因可克隆进多克隆位点，在P_(CMVIE)控制下表达。pLNCX_2含有包装信号Ψ序列，但没有gag、pol和env等编码病毒结构蛋白的基因，须通过包装细胞系(PT67等)的包装。因此，当转染细胞增殖传代时，其形成复制完整病毒能力的的机会极少。其包装产生的病毒，携带前脑啡肽源基因，可作为疼痛基因治疗的实验研究的有力工具。 目的 研究利用RT-PCR技术，可否获得人前脑啡肽原基因，并采用pLNCX2逆转录病毒载体，将外源性脑啡肽基因导入并整合到靶细胞NIH3T3细胞的基因组中，观察是否有外源性脑啡肽基因的表达，探讨一条有效的治疗疼痛的转基因方法。 方法 1．RT-PCR 根据GenBank报道的人脑啡肽基因序列(NM_006211)，设计引物，其引物5’与3’端分别加上HindⅢ和NotⅠ酶切位点，以便目的基因插入逆转录病毒载体。提取人脑组织总RNA，然后反转录得到包含前脑啡肽原基因的单链总cDNA，(本文来源于《郑州大学》期刊2006-05-16）
高峰[10]（2006）在《人前脑啡肽原基因修饰永生化大鼠神经前体细胞株的构建及其镇痛效应研究》一文中研究指出疼痛是一种常见的临床症状，很多病理性疼痛本身就是一种严重影响患者生活质量的疾病。对于慢性疼痛的治疗，传统的药物镇痛有诸多不可避免的缺陷，尤其是长期用药所致的药物耐受及依赖，将直接导致治疗的失败，因此寻找一种安全有效、作用持久的镇痛方法已成为疼痛研究的重要方向。转基因细胞移植镇痛是近年来疼痛研究的新领域，有望为疼痛治疗提供一种全新的技术和方法。神经前体细胞(neural progenitor cell，NPC)是一类可以分裂增殖、自我更新并具有多分化潜能的细胞。NPC作为神经细胞的种子细胞，在细胞移植治疗和细胞介导的基因治疗中具有潜在的临床应用价值。但原代培养的NPC增殖速度较慢，传代周期长，且为多克隆起源，难以满足科研和临床研究的需要。而永生化神经前体细胞在体外培养中能够自我更新和无限扩增，可以提供大量表型、基因型稳定的神经前体细胞，是转基因治疗的理想细胞载体。脑啡肽是一种内源性的阿片肽，由前脑啡肽原经酶切加工而来，广泛分布于外周和中枢神经系统，是中枢神经系统重要的镇痛介质。本研究旨在构建人前脑啡肽原基因(human preproenkephalin gene，hPPE)修饰的永生化大鼠神经前体细胞株，并通过将其移植入神经病理性痛大鼠蛛网膜下腔，以评价其用于镇痛治疗的有效性和安全性。研究方法与结果1、猿肾病毒40大T抗原永生化大鼠神经前体细胞株的构建方法：采用贴壁法体外培养新生鼠室管膜下区神经前体细胞，利用脂质体介导的基因转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原(simian virus 40 large tumor antigen，SV40Tag)基因的质粒pCMVSV40T／PUR转染神经前体细胞，经嘌呤霉素筛选，阳性克隆扩大培养并进行连续传代。观察细胞的形态及其生长状况，应用巢蛋白抗体进行细胞鉴定，5％胎牛血清诱导细胞分化后，应用免疫细胞化学法检测其分化能力。采用RT-PCR、Southern印迹杂交和免疫细胞化学法检测SV40Tag在转染细胞中的表达。结果：体外成功培养神经前体细胞，细胞巢蛋白表达阳性，可诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞；转染SV40Tag后经筛选培养后获得1个阳性细胞克隆，免疫细胞化学结果显示细胞的巢蛋白和微管相关蛋白2染色为阳性，增殖能力较强。5％胎牛血清可诱导转染细胞分化为微管相关蛋白2阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。Southern印迹杂交结果显示转染细胞基因组中存在SV40Tag cDNA，并可检测到SV40Tag mRNA及其蛋白的表达。转染细胞经扩大培养，命名为永生化神经前体细胞(immortalized neural progenitor cell，INPC)。2、永生化大鼠神经前体细胞生物学特性研究方法：选用连续传代培养的INPC，观察传代、冻存和复苏对细胞形态及生长状况的影响，透射电镜观察细胞的超微结构，应用细胞生长曲线、5’溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)掺入法和流式细胞仪检测细胞增殖能力，采用裸鼠接种实验检测细胞的致瘤性，通过检测细胞分化前后MHCⅠ和Ⅱ类分子的表达评价其免疫原性。结果：贴壁培养的INPC形态以椭圆形或叁角形为主，有两个或叁个短的突起。细胞胞体较小，胞核较大，呈圆形，胞浆较少。细胞呈单层生长，存在接触抑制现象。冻存与复苏不改变INPC细胞的形态及增殖能力，目前已传至50余代。与原代NPC相比，INPC细胞增殖指数和增殖率升高，群体倍增时间缩短。裸鼠接种实验未见有新生物长出。在常规培养条件下，有少量的INPC表达MHCⅠ和Ⅱ类分子，而5％胎牛血清诱导INPC分化后，MHCⅠ和Ⅱ类分子的表达均为阴性。3、人前脑啡肽原基因修饰永生化大鼠神经前体细胞株的构建方法：携带hPPE的重组腺相关病毒2型(recombinant adeno-associated virus type 2，rAAV_2)rAAV_2／hPPE和含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的对照载体rAAV_2／eGFP分别转染INPC，转染rAAV_2／eGFP 12h后开始应用倒置荧光显微镜观察转rAAV_2／eGFP INPC绿色荧光蛋白的表达，并计算转染效率，应用巢蛋白抗体和猿肾病毒40抗体进行细胞鉴定。5％胎牛血清诱导转rAAV_2／hPPE INPC分化后，应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力。采用免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法检测转染细胞hPPE、亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephalin，L-EK)的表达与分泌。结果：INPC转染rAAV_2／eGFP 12h后即有绿色荧光蛋白表达，转染72h后，大部分细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率可达90％。免疫细胞化学结果显示INPC转染rAAV_2／hPPE后nestin和SV40抗体染色均为阳性，且可被血清诱导分化为神经元和星形胶质细胞。免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法结果均表明转rAAV_2／hPPE永生化神经前体细胞hPPE的表达与L-EK的分泌均明显高于未转染细胞(P＜0.01)。4、慢性神经病理性痛大鼠鞘内移植人前脑啡肽原基因修饰永生化大鼠神经前体细胞的镇痛效应方法：成年雌性SD大鼠40只，随机分为五组：Naive组，大鼠不进行任何处理；Sham组，大鼠仅暴露右侧坐骨神经分支；SNI组，大鼠右侧下肢行保留性神经损伤(spared nerve injury，SNI)手术；INPC组和INPC／hPPE组大鼠分别于SNI术后1周鞘内移植BrdU标记的永生化神经前体细胞INPC或转rAAV_2／hPPE永生化神经前体细胞(INPC／hPPE)。持续观察大鼠行为学改变，分别于SNI术前、SNI术后1周至细胞移植后8周内每周测定各组大鼠50％机械缩爪阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和热缩爪潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。于细胞移植8周后取各组大鼠L_(4-6)脊髓组织，应用免疫组织化学法检测移植细胞BrdU和L-EK的表达，采用RT-PCR和放射免疫法检测hPPE、L-EK的表达及分泌。结果：SNI术后1周，大鼠出现疼痛行为学症状，MWT和TWL降低(P＜0.05)；细胞移植后1周，INPC／hPPE组大鼠疼痛行为学症状明显减轻，MWT和TWL升高(P＜0.05)，到细胞移植后第3周，已基本恢复至正常水平。细胞移植后8周，INPC组和INPC／hPPE组大鼠脊髓背角软脑膜和脊髓浅层中均可检测到移植细胞BrdU染色，免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法结果均表明INPC／hPPE组hPPE的表达和L-EK的分泌高于其它四组(P＜0.05)。5、统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差((?)±S)表示，组内、组间比较采用单因素方差分析；计数资料以率表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。研究结论成功地构建了猿肾病毒40大T抗原永生化的大鼠神经前体细胞株，该永生化细胞保留了原代NPC的细胞表型，为良性转化细胞，体内外实验证实可作为载体细胞安全地用于转基因细胞移植研究；构建了高表达亮氨酸脑啡肽的人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠神经前体细胞株，将此细胞植入慢性神经病理性痛大鼠蛛网膜下腔，可获得长效、稳定、安全的镇痛效果。研究总结本研究采用脂质体介导的基因转染技术成功地构建了永生化大鼠神经前体细胞株，并对细胞的生物学特性进行了全面的研究，该细胞株的成功构建解决了原代细胞培养数量不足及生存时间有限的问题，为中枢神经系统疾病的治疗与转基因细胞移植提供了安全、可靠的细胞平台，永生化细胞构建技术具有良好的临床应用前景。抗痛基因修饰的永生化神经前体细胞进行鞘内移植可有效缓解慢性神经病理性痛，是一种安全、有效、可行的细胞镇痛方法，这不仅是对顽固性疼痛治疗所进行的一次探索性研究，而且可为基因治疗应用于临床奠定了基础。(本文来源于《华中科技大学》期刊2006-04-01）
前脑啡肽原基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
前脑啡肽原基因论文参考文献
[1].白凤.慢病毒介导的人前脑啡肽原基因在HEK293细胞中的表达[D].山西医科大学.2014
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