猪圆环病毒2型Cap基因多拷贝质粒的构建及病毒样颗粒的表达

论文摘要

通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap的毕赤酵母菌株。将Cap的基因克隆到pPIC3.5K载体中后,利用同尾酶技术将表达盒（5′AOX-Cap-TT）重复插入载体,分别构建了含有1、2、4、6个拷贝基因数的表达质粒并通过电转化导入KM71菌株,重组菌株经发酵和甲醇诱导,通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达;绘制不同拷贝数重组菌株的生长曲线;表达产物经纯化后透射电镜观察是否组装形成病毒样颗粒（VLPs）并免疫小鼠评估其免疫原性。Western blot结果显示,Cap蛋白能够在酵母细胞内表达,且6拷贝质粒的重组菌表达量最高;生长曲线显示拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响;电镜下观察到表达的Cap蛋白能够自发装配成直径约为20 nm、与天然PCV2粒子大小相当、均一的VLPs;纯化后的VLPs免疫接种小鼠后能有效刺激机体产生PCV2抗体。含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高重组毕赤酵母中Cap的表达量。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 实验动物
•     1.1.2 疫苗
•     1.1.3 试剂、质粒及酵母菌株
•   1.2 方法
•     1.2.1 重组表达质粒pPIC3.5K-Cap及多拷贝表达质粒pPIC3.5K-2Cap、pPIC3.5K-4Cap、pPIC3.5K-6Cap的构建
•     1.2.2 不同拷贝表达质粒电转化KM71宿主菌
•     1.2.3 Cap的诱导表达及表达量比较
•     1.2.4 不同拷贝数重组酵母的生长曲线绘制
•     1.2.5 表达产物的PEG沉淀纯化及电镜观察
•     1.2.6 小鼠免疫试验
• 2 结果
•   2.1 构建不同拷贝数重组表达质粒
•   2.2 目的蛋白的诱导表达、鉴定及表达量比较
•   2.3 不同拷贝数重组酵母的生长曲线
•   2.4 Cap蛋白的纯化以及电镜观察其形成的VLPs
•   2.5 小鼠免疫试验结果
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 尹曼曼,刘汉平,楼觉人

关键词: 猪圆环病毒型,蛋白,多拷贝数,毕赤酵母,病毒样颗粒

来源: 动物医学进展 2019年09期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 上海海利生物技术股份有限公司/上海市兽用生物制品工程技术中心

基金: 2015年上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字(2015)第1-12号)

分类号: S852.651

DOI: 10.16437/j.cnki.1007-5038.2019.09.001

页码: 1-6

总页数: 6

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