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拟南芥GOLDEN 2-LIKE转录因子参与调控ABA应答基因表达机制的研究

2020-12-02阅读(1100)

拟南芥GOLDEN 2-LIKE转录因子参与调控ABA应答基因表达机制的研究

论文摘要

脱落酸（Abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素。ABA在植物生长发育、种子萌发、休眠和胁迫应答等方面发挥重要的调控作用。在拟南芥中约有1500个转录因子调控ABA信号参与的胁迫应答基因的表达,这些转录因子通过结合到下游基因的启动子上激活或抑制基因表达来应答ABA信号。GARP家族蛋白具有GARP类转录激活结构域,在叶绿体发育、细胞分裂素信号转导、磷代谢过程、器官极性调控等多种生理过程中具有重要作用。拟南芥GLK属于GARP转录因子家族,但到目前为止,GLK1/2是否参与以及如何调节脱落酸（ABA）响应过程尚不清楚。本文对拟南芥GLK1/2参与并调控ABA应答过程中的基因表达的分子机制开展了相关研究,发现双突变体glk1 glk2在种子萌发和幼苗发育过程中表现出对ABA更加敏感,而过表达转基因植物（glk1ox-1、glk1ox-2、glk2ox-1和glk2ox-2）在种子萌发和幼苗发育过程中表现出对ABA的敏感性降低,这些结果表明拟南芥转录调控因子GLK1/2参与了ABA应答过程。对WT,glk1,glk2和glk1 glk2进行不同浓度的甘露醇和Nacl条件胁迫,结果发现,与WT相比,glk1 glk2双突变体的根系较长,而glk1-ox和glk2-ox表现出对渗透胁迫和盐胁迫更加敏感的表型;干旱胁迫实验发现,与WT、glk1和glk2相比,glk1 glk2的存活率明显更高。这些结果表明,GLK1/2可以负调控高渗胁迫和干旱胁迫应答过程。为了探究GLKs的转录活性,利用原生质体转染系统共同转染了报告基因和effector（GD-VP16、GD-GLK1和GD-GLK2）,发现与负对照相比,GD-GLK1和GD-GLK2诱导了报告基因的显著性表达,表明GLK1和GLK2具有转录激活活性。我们进一步检测发现GLK1和GLK2可以激活WRKY40、RbohB、COR15A和COR15B表达。通过转录组测序分析,我们发现在正常条件下,与WT相比,glk1 glk2中有394个上调基因（URGs）和844个下调基因（DRGs）;在处理10μM ABA后,glk1 glk2中有877个上调表达基因（URGs）和841个下调表达基因（DRGs）。通过对glk1 glk2中的差异表达基因进行功能注释与富集分析发现在处理ABA后,差异表达基因富集在氧化还原反应、转录调控、激素信号传导、干旱应答等生理过程。为了鉴定GLK1/2在应答ABA时的转录靶点目标,我们选择与“非生物胁迫响应”、“干旱响应”有关的差异表达基因,分析其启动子序列,共有13个基因的启动子区含有GLK识别的保守序列,据报道WRKY40可以负调控ABA应答过程,我们推测WRKY40可能是GLK的下游靶基因。进一步实验发现在使用β-雌二醇诱导GLK1和GLK2表达后,WRKY40 pro:LUC被激活;然而突变掉保守的GLK1/2结合结构域时,LUC活性不能被诱导,这个结果表明GLK1/2介导的转录激活需要高度保守的GLK1/2识别位点。此外,我们体外进行了EMSA实验来检测GLK1/2结合的保守DNA序列,发现GLK1/2可以与含有P2结构域的探针结合,当把P2探针序列突变后（CCAATC）,其结合能力显著降低。同时,我们利用染色质免疫沉淀分析和凝胶阻滞实验发现GLK1/2通过保守序列与WRKY40的启动子结合。为了鉴定GLK1/2和WRKY40是否在ABA应答途径中在同一个通路发挥功能,我们对glk1 glk2和wrky40进行了转录组测序,发现在处理ABA后,受GLK1/2和WRKY40调控的ABA响应基因大部分都是重合的,表明GLK1/2和WRKY40协同的应答ABA信号。通过qRT-PCR分析也发现,在glk1 glk2、wrky40和glk1 glk2 wrky40中,ABI5和DIN11基因表达均上调,RbohB和COR15A表达均下调。因此,我们认为GLK1/2和WRKY40在ABA响应途径中调控大量共同的下游靶基因表达。突变体glk1 glk2和pyr1 pyl1 pyl2 pyl4的在种子萌发和幼苗生长中对ABA的敏感性是相反的,而转录组测序分析结果发现这两个突变体的差异表达基因大部分都是重叠的,表明在ABA受体PYL/PYR介导的ABA信号转导途径中,GLK1/2可能作为负调控蛋白,其转录水平受到PYL/PYR-PP2C-SnRKs的负调控。在种子萌发和幼苗发育阶段,与WT和glk1、glk2单突变体相比,glk1 glk2和wrky40表现出ABA高敏表型。有趣的是,glk1 wrky40,glk2 wrky40和glk1 glk2 wrky40与wrky40均展示出相似的ABA敏感度,我们在glk1 glk2背景下过量表达WRKY40,观察到glk1 glk2的ABA高敏表型被抑制了。这些结果表明WRKY40在种子萌发阶段和种子发育过程中可能在GLK1/2的下游发挥作用。通过转录组测序,我们发现在ABA处理下,ABI5的表达水平在glk1 glk2双突变体中上调。我们利用CRISPR-Cas9技术构建abi5-7 glk1 glk2 wrky40四突突变体。遗传学实验表明,三突变体glk1 glk2 wrky40表现出与wrky40单突变体和glk1 glk2双突变体相似的ABA高敏表型,而glk1 glk2 wrky40 abi5-cr-1,glk1 glk2 wrky40 abi5-cr-2和glk1 glk2 wrky40 abi5-cr-3四突变体却表现出与abi5-7相似的ABA低敏感表型。这些结果表明,ABI5在GLK1/2和WRKY40的遗传学下游起作用,GLK1/2-WRKY40转录模型在ABA应答过程中起着负调控作用,与野生型相比,GLKs突变体在渗透胁迫和盐胁迫条件下表现出更强的耐受性,我们的实验结果为提高植物的抗逆性,提高植物在逆境下的存活率,提高作物的产量等具有实际指导意义。

论文目录

  • Abstract
  • 摘要
  • Introduction
  •   1.1.Germination
  •   1.2.Abiotic Stress
  •   1.3.Phytohormone
  •   1.4.Abscisic Acid（ABA）
  •   1.5.ABA has a Key Role in Germination
  •   1.6.Transcription Factors ABI5 and ABI3
  •   1.7.Abiotic Stress Particularly Drought Stress Affect Root Growth and Germination Process
  •   1.8.WRKY Transcription Factor
  •   1.9.Transcription Factor WRKY40
  •   1.10.GOLDEN2-like Transcription Factor GLK
  •   1.11.Transcription Factor GLK1/2 Involve in Germination
  • Material and Methods
  •   2.1.Plant Materials and Growth Conditions
  •   2.2.Construction of Plasmids and Generation of Transgenic Plants
  •   2.3.Assays of Sensitivity to ABA and Osmotic Stress
  •   2.4.RNA-sequence analysis
  •   2.5.Protoplast Isolation,Transfection,and GUS Activity Assay
  •   2.6.Induced Transgene Expression in Stably Transformed Arabidopsis Plants
  •   2.7.Transient Dual-luciferase Reporter System
  •   2.8.Chromatin Immunoprecipitation Assays
  •   2.9.Pull-down Assay and EMSA
  •   2.10.DAB and NBT Staining Assay
  •   2.11.Drought Tolerance Analysis
  •   2.12.Seed Germination and Seedling Establishment Assays
  • Results
  •   3.1.A glk1 glk2 Double Mutant Displays Increased ABA-sensitivity During Seed Germination,Seedling Growth,and Induced Seed Dormancy
  •   3.2.GLK1 and GLK2 Modulate ABA-mediated Regulation of Gene Expression
  •   3.3.GLK1 and GLK2 Negatively Control the Osmotic and Dehydration Stress Responses
  •   3.4.GLK1/2 specifically Activate the Expression of Some Essential ABA-responsive Genes
  •   3.5.GLK1/2 Control the Expression of WRKY40 via Direct Binding at the Consensus Sequence Located at the Promoter Region
  •   3.6.GLK1/2 and WRKY40 Share Common Target Genes in Response to ABA
  •   3.7.GLK1/2 and WRKY40 Function in the Same Genetic Pathway
  • Discussion
  • Conclusion
  • References
  • Abbreviation
  • Acknowledgements
  • 在学期间公开发表论文及著作情况

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: RAFIQ AHMAD

    导师: 徐正一

    关键词: 拟南芥,脱落酸,转录因子,渗透胁迫,转录调控

    来源: 东北师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 东北师范大学

    分类号: Q943.2

    总页数: 93

    文件大小: 4352K

    下载量: 198

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