寡孢节丛孢钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶（CaMKs）功能的研究

论文摘要

寡孢节丛孢（Arthrobobrys oligospora）是一种典型的捕食线虫真菌,通过产生特殊的捕食器官-三维菌网（three-dimensional networks）来捕捉和侵染线虫,寡孢节丛孢是研究真菌与线虫相互作用的代表性菌株。钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent kinases,CaMKs）是一类重要的多功能信号蛋白,位于G蛋白信号的下游,在激素或次级信使的调控下,参与胞内信号传导,调节多种不同的生物学过程。本论文选取寡孢节丛孢为试验菌株,以5种CaMKs（CaMK A,AOL s00078g95;CaMK B,AOL s00083g485;CaMKK Cl,AOLs00215g625;CaMKKC2,AOLs00110g86;CaMKD,AOLs00080g218）为研究对象,通过基因敲除、表型特征比较、环境胁迫耐受试验和荧光定量PCR等技术,初步探究了 5种CaMKs在寡孢节丛孢生长发育、环境胁迫耐受、产抱和致病过程中的功能。主要实验结果:1.CaMKs的功能结构域、理化性质和聚类分析功能结构域分析表明,5种CaMK蛋白都含有保守的protein kinase-like结构域和protein kinase结构域之外,还含有一些其它的功能位点,如丝/苏氨酸蛋白激酶活性位点（IPR008271）,ATP结合位点（IPR17441）和保守的活化环（activation loop）。同时,对CaMK蛋白的理化性质分析表明,CaMKK C2的分子量较大为128.7 kDa,其余4种CaMK蛋白的分子量相对较小;而5种CaMK蛋白的等电点没有明显的差异。聚类分析表明,寡孢节丛孢中的5种CaMKs聚类形成两个不同的进化分支（Ⅰ和Ⅱ）,其中Ⅰ分支为CaM kinases,Ⅱ分支为CaM kinase kinases。2.CaMKs编码基因敲除株的生长速率和环境胁迫耐受性分析构建了 CaMKs编码基因的敲除载体,运用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法,成功获得了 5种CaMKs蛋白编码基因的敲除突变菌株。然后比较敲除株与野生型菌株的生长表型特征,包括生长速率、菌落形态、抗逆性和环境胁迫耐受性（耐高温和抗紫外辐射）等。分析结果表明△CaMKs敲除株的生长速率变慢,且ACaMKK C2突变株的气生菌丝较为致密。抗逆性实验分析表明,△CaMKs敲除株的生长受到抑制,它们对不同化学试剂（如H2O2、menadione、SDS和Congo red）的敏感程度不同。环境胁迫耐受性试验结果表明,5种CaMKs在不同程度上都参与了寡孢节丛孢的耐高温和紫外应激过程。3.△CaMKs敲除株的产孢量和致病性分析与野生型菌株相比,5种△CaMKs敲除株的产孢数量均明显减少。为了进一步探讨CaMKs对产孢的调控作用,收取培养3、5和7d的敲除株和野生株的菌丝样品进行总RNA提取,再反转录为cDN△。选取了寡孢节丛孢基因组中12个与产孢相关的同源基因进行RT-PCR分析,结果表明产孢基因FlbA、FlbC、MedA、NsdD、Pka、VelB、VosA和VeA的转录水平在敲除株中都明显下调。另外,5种△CaMKs敲除株产生的捕食器官数量和杀线虫率都显著低于野生型菌株,且△CaMK B突变株产生捕食器官的时间发生了延迟。以上实验结果表明CaMKs参与了寡孢节丛孢的产孢和致病性等生物学过程的调控。本文的创新点:1.本论文首次对捕食线虫真菌的CaMKs功能进行了报道,成功敲除了寡孢节丛孢中5种CaMK蛋白的编码基因,表型特征比较表明CaMK蛋白在寡孢节丛孢中参与了多种重要的生物学过程调控,如菌丝生长、产孢、环境压力耐受、捕食器官形成和致病性等。2.比较了△CaMK 敲除株在高温条件下的表型变化,包括生长速率、孢子数量和孢子萌发率,推测CaMK蛋白参与寡孢节丛孢高温胁迫条件下的生长和产孢过程。3.比较了△CaMK 敲除株在紫外辐射下的孢子生存率变化,发现△CaMKs敲除株对紫外辐射敏感度高于野生型菌株,其中△CaMKA对紫外辐射最为敏感,说明CaMK蛋白参与了寡孢节丛孢的紫外胁迫生长调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 食线虫真菌及CaMK蛋白研究进展
•   1 植物病原线虫的危害及生防因子的研究概况
•   2 食线虫真菌的研究概况
•   3 CaMK蛋白的功能研究进展
•   4 本论文的选题依据及研究意义
• 第二章 CaMKs蛋白的序列特征和聚类分析
•   1 前言
•   2 材料与方法
•     2.1 CaMK蛋白序列来源
•     2.2 CaMK蛋白功能结构域分析
•     2.3 CaMK蛋白系统发育分析及其命名
•   3 结果
•     3.1 CaMK蛋白的部分理化性质和功能结构域分析
•     3.2 CaMK蛋白的系统进化分析
•   4 讨论
• 第三章 CaMK蛋白编码基因的敲除和转化子验证
•   1. 前言
•   2 实验材料及仪器
•     2.1 试验菌株和质粒
•     2.2 主要溶液及培养基
•     2.3 实验药品及试剂盒
•     2.4 主要仪器及设备
•   3 实验方法
•     3.1 敲除载体构建方法
•     3.2 敲除引物设计
•       3.2.1 29 bp同源臂序列及扩增潮霉素抗性基因的引物
•       3.2.2 扩增5个CaMK基因的引物
•     3.3 寡孢节丛孢基因组提取
•     3.4 质粒pSCN44和pRS426的提取
•     3.5 pRS426质粒双酶切及片段纯化回收
•     3.6 目的片段的扩增和纯化回收
•     3.7 FY834菌株感受态制备及电转
•     3.8 酵母转化子质粒提取
•     3.9 酵母转化子验证
•     3.10 敲除载体全长片段扩增及纯化回收
•     3.11 寡孢节丛孢原生质体的制备及转化
•     3.12 转化子基因组提取
•     3.13 阳性转化子PCR验证
•     3.14 阳性转化子的Southern blot验证
•   4 实验结果
•     4.1 寡孢节丛孢5个CaMK蛋白编码基因上下游同源片段及hph基因片段扩增
•     4.2 pRS426质粒双酶切
•     4.3 酵母转化子
•     4.4 酵母转化子质粒PCR验证
•     4.5 阳性转化子PCR验证
•     4.6 阳性转化子Southern blot验证
•   5 讨论
•     5.1 敲除载体的构建
•     5.2 原生质体的制备及转化
•     5.3 敲除转化子PCR验证
•     5.4 敲除转化子Southern blot验证
•   6 小结
• 第四章 寡孢节丛孢野生株与△CaMKs突变株的生长速率和产孢分析
•   1 前言
•   2. 实验材料及仪器
•     2.1 实验菌株
•     2.2 主要培养基
•     2.3 主要药品
•     2.4 主要仪器及设备
•   3. 实验方法
•     3.1 生长速率比较
•     3.2 产孢的比较
•     3.3 野生型菌株和突变菌株样品总RNA的提取
•     3.4 反转录获得cDNA
•     3.5 相关基因的选取及引物设计
•     3.6 Real-Time PCR
•   4 实验结果
•     4.1 CaMK蛋白在寡孢节丛孢中表达量分析
•     4.2 CaMK基因突变菌株生长速率及菌落形态比较
•     4.3 CaMK蛋白突变菌株的产孢能力比较
•     4.4 产孢相关基因定量结果
•   5 讨论
•     5.1 生长速率和菌落形态比较
•     5.2 CaMK蛋白在菌丝生长不同时间点转录水平比较
•     5.3 产孢比较
•     5.4 产孢相关基因定量结果
•   6 小结
• 第五章 寡孢节丛孢野生株与△CaMKs突变株的环境胁迫耐受性分析
•   1 前言
•   2 实验材料及仪器
•     2.1 实验菌株
•     2.2 主要培养基
•     2.3 主要药品
•     2.4 主要仪器及设备
•   3 实验方法
•     3.1 抗高渗比较
•     3.2 抗氧化比较
•     3.3 抗细胞壁合成比较
•     3.4 热应激比较
•     3.5 抗紫外辐射比较
•   4 实验结果
•     4.1 CaMK蛋白突变菌株的抗高渗比较
•     4.2 CaMK蛋白突变菌株的抗氧化比较
•     4.3 CaMK蛋白突变菌株的抗细胞壁合成干扰剂的能力比较
•     4.4 CaMK蛋白突变菌株的热应激敏感性比较
•     4.5 CaMK蛋白突变菌株高温胁迫下孢子萌发率比较
•     4.6 CaMK蛋白突变菌株高温胁迫恢复能力比较
•     4.7 CaMK蛋白敲除突变菌株高温胁迫下产孢量比较
•     4.8 CaMK蛋白突变菌株抗紫外辐射比较
•   5 讨论
•     5.1 抗逆性比较
•     5.2 抗氧化比较
•     5.3 抗细胞壁合成比较
•     5.4 热应激比较
•     5.5 抗紫外辐射比较
•   6 小结
• 第六章 寡孢节丛孢野生型菌株与△CaMKs突变菌株的捕器形成和致病性分析
•   1 前言
•   2 实验材料及仪器
•     2.1 实验菌株
•     2.2 主要培养基
•     2.3 主要药品
•     2.4 主要仪器及设备
•   3 实验方法
•     3.1 捕器数量及形态比较
•     3.2 杀线虫率比较
•   4 实验结果
•     4.1 CaMK蛋白突变菌株的捕器形态比较
•     4.2 CaMK蛋白突变菌株的捕器数量比较
•     4.3 CaMK蛋白突变菌株的杀线虫率比较
•   5 讨论
•   6 小结
• 全文小结及存在的问题
• 参考文献
• 附录
•   附录Ⅰ 论文中使用的缩写及中英文对照
•   附录Ⅱ 论文中使用的质粒图谱
•   附录Ⅲ 论文RT-PCR序列
•   附录Ⅳ 硕士阶段发表的文章
•   附录Ⅴ 硕士阶段获得的奖励和荣誉
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 甄政毅

导师: 杨金奎

关键词: 寡孢节丛孢,蛋白,产孢,捕食器官,环境胁迫耐受性,致病性,转录水平

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 云南大学

基金: NSFC-云南联合基金重点项目:捕食线虫真菌形成捕食器官的信号调控机制研究(项目编号:U1402265)

分类号: Q936

总页数: 104

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