萼花臂尾轮虫衰老过程中体内相关基因活化特征及其分子机制研究

论文摘要

轮虫动物门（Phylum Rotifera）分为尾盘纲（Seisona）、双巢纲（Digononta）和单巢纲（Monogononta）。单巢纲轮虫生活史具有世代交替现象,在适宜环境条件下行孤雌生殖,非混交雌体（Amictic-female）产生非需精卵,不需受精,直接萌发成子代非混交雌体,使种群迅速繁衍。环境条件恶劣时,种群出现混交雌体（Mictic-female）,进入有性生殖阶段。混交雌体的卵不受精时直接萌发为雄体,雄体与混交雌体交配,产生休眠卵,进入育期。轮虫在孤雌生殖阶段,母体性成熟后,通常携带1-3个非需精卵,4日龄开始进入衰老期。其衰老特征主要表现为:游泳速度迟缓、沉底贴壁、体壁几丁质增厚、消化道空瘪、个体的后棘刺显著加长。由于轮虫与线虫结构特征具有诸多相似之处（如,体壁具有角质层、个体体细胞数量恒定和具有初生体腔）,过去曾被归为线虫动物门（Phylum Nematoda）轮虫纲（Rotifer）。现行的动物分类系统把轮虫另立为轮虫动物门,与线虫动物门等具另外七个具有初生体腔的动物一起,被列入假体腔动物（Pseudocoelomata）类。随着分子生物学研究新技术的发展和应用,目前国际同行已开始尝试利用轮虫为试验材料,开展热休克蛋白参与衰老相关信号通路的调控,以期揭示轮虫是否通过调节HSP70参与的相关信号通路来延长其寿命。目前,轮虫（Adineta vaga）基因组以及与轮虫具有类似生活史和生殖模式的枝角类（Daphnia pulex）基因组已经公布,热休克蛋白活性特征及其通过相关信号通路的调控,影响轮虫衰老的研究逐渐引起人们的关注。轮虫分布广泛、个体微小、繁殖速度快、易于培养、寿命周期短,可以在μL容积中培养观察,实验操作简便。加上利用休眠卵萌发的个体,建立源于单个轮虫来源的品系的方法简便、能在短时间内获得生理特性较为一致性的健康个体,能最大限度的减少实验材料带来的实验误差。所以,轮虫和线虫一样,是衰老生物学研究的理想受试动物。相关研究发现,萼花臂尾轮虫通过诱导产生的MnSOD和CAT对延缓轮虫的衰老起着重要的作用,其作用效果比在线虫中作用更显著。,其作用效果比在线虫中作用更显著。基于轮虫开展的衰老生物学研究成果,为动物衰老机理研究的相关理论（如,自由基理论（Free radical theory of aging））的发展做出了巨大贡献。基于轮虫开展的衰老生物学研究成果,为动物衰老机理研究的相关理论的发展做出了巨大贡献。本文研究结果主要包括以下6个方面:1.槲皮素对轮虫寿命、生殖以及抗氧化性研究本章实验结果表明:适当浓度槲皮素（20μM）对萼花臂尾轮虫的寿命有着显著影响,而高浓度槲皮素（50μM）表现出对轮虫的急性毒理效应,严重干扰其生殖。在20μM槲皮素中培养的轮虫的寿命显著高于对照组（15%）。此外,MnSOD和CAT的mRNA表达量也显著增加。在高温环境（35°C）产生的氧化压力下,槲皮素处理能够降低轮虫体内ROS含量,并增加轮虫的存活率。本结论强调了槲皮素主要通过改善轮虫机体的抗氧化能力来延长轮虫寿命。2.基于RNAi技术揭示SIR2基因在调控轮虫寿命的作用机理本章实验结果表明:20μM槲皮素处理组与12CR处理组轮虫SIR2基因表达量在处理36h时显著高于对照组（P<0.05）。当对SIR2基因进行干扰后,槲皮素、饮食限制处理组轮虫平均寿命与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。这表明SIR2基因参与了轮虫由饮食限制、抗氧化剂所激发的代谢通路,并起到了延长轮虫寿命的作用。我们的研究结果首次确立了SIR2活性在调节轮虫寿命方面的作用。随着轮虫成为研究衰老的模式生物,萼花臂尾轮虫SIR2基因作用机制分析将得到进一步的完善。3.低温延长轮虫寿命的热力学效应和基因调控研究通过本章节实验,我们发现当培养温度为20°C和15°C时,平均寿命分别为170.5±12.5 h和13.6±8.6 h,显著高于25°C对照组（102.2±7.4 h）,并且20°C处理组轮虫在急性氧化条件下的存活率也要显著高于对照组（P<0.05）。这表明低温延长萼花臂尾轮虫的寿命并不是被动的完全受温度调控的,在轮虫生命初始,低温环境可能调节了特定基因的表达。由于低温导致轮虫寿命延长这一效果具有持续性,即使在第四天将轮虫移入25°C培养,轮虫平均寿命也要显著高于对照组（P<0.05）。RNA干扰实验中,我们发现进行基因干扰后,低温对轮虫寿命延长效果下降,但仍然显著高于对照组轮虫平均寿命（P<0.05）。这说明在低温导致轮虫寿命延长的现象中,基因调控要比热力学效应发挥更大的作用。4.在轮虫衰老过程中钙稳态的相关研究本章实验结果表明:萼花臂尾轮虫SERCA基因表达量会随着轮虫衰老程度的增加而降低。硝苯地平阻止了钙离子进入轮虫细胞,显著减少了轮虫在第5日时体内钙离子和丙二醛的含量（P<0.05）,同时显著延长了轮虫的寿命（对照组平均寿命为99.5±16.5 h,0.5μM硝苯地平处理组为125.8±12.9 h,P<0.05）。这些实验结果表明钙离子在轮虫衰老过程尤其在生命后期中起着十分关键的作用,并且由这种钙稳态导致的细胞损伤是可以通过添加药物处理来改善的。5.亲代不同温度经历对子代耐受性的影响本章实验中我们检测了萼花臂尾轮虫两种母体效应（母代生殖年龄和母代不同食物喂养方案）对后代的影响。我们发现母代的年龄影响了后代寿命,体型的大小,并且母代进行饮食限制后可以在一定程度上降低一些负面影响。当CR处理组子代同样进行CR处理时,子代平均寿命显著高于母。CR实验组所产第三个子代平均寿命显著高于AL对照组所产第三个子代平均寿命,这说明对母代进行适当的饮食限制可以降低生育年龄对子代的不利影响。6.不同年龄组轮虫处于高浓度CO2条件下,寿命长短、压力防御基因的表达量变化分析本章实验结果表明,水体酸化对B.calyciflorus种群增长率和平均产卵量均显著低于对照组（P<0.05）。虽然实验组轮虫生殖前期与对照组无显著差别,但净生殖率却因水体酸化而显著降低。我们发现在不同年龄组轮虫中,过氧化氢酶CAT和热休克蛋白HSP70基因的mRNA表达受水体酸化影响,且表达量显著高于对照组（P<0.05）;相同年龄组不同处理条件下的mRNA表达量与对照组相比也有显著差别。本章实验揭示了当轮虫受到酸化水体影响时,种群的年龄结构是一个很重要的参与因素,因为年龄结构可能会改变能量的重新分配和生物对环境的耐受性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 轮虫:衰老学研究模型
•   1.2 衰老学研究进展
•     1.2.1 外源抗氧化剂对生物寿命的影响
•     1.2.2 饮食限制对生物寿命的影响
•     1.2.3 环境温度对生物寿命的影响
•     1.2.4 钙稳态在生物衰老过程中的作用
•   1.3 轮虫应对环境压力时对寿命调控的适应性策略
•     1.3.1 母体效应对子代表型的影响
•     1.3.2 淡水浮游生物对环境的响应
•   1.4 本论文的研究目的及研究内容
•     1.4.1 研究目的
•     1.4.2 研究主要内容
•     1.4.3 研究框架
•     1.4.4 本研究的主要创新点
• 第2章 槲皮素对轮虫寿命、生殖以及抗氧化性研究
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 轮虫的培养
•     2.2.2 藻类的培养
•     2.2.3 实验仪器、试剂
•     2.2.4 实验设计
•     2.2.5 萼花臂尾轮虫总RNA提取
•     2.2.6 轮虫RNA质量、浓度的测定
•     2.2.7 cDNA反转录合成
•     2.2.8 荧光定量PCR
•     2.2.9 数据分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 不同浓度槲皮素对萼花臂尾轮虫寿命的影响
•     2.3.2 槲皮素对萼花臂尾轮虫繁殖的影响
•     2.3.3 槲皮素对萼花臂尾轮虫MnSOD,CAT基因表达的影响
•     2.3.4 槲皮素预处理对萼花臂尾轮虫在高温下存活率以及ROS积累的影响
•   2.4 讨论
•   2.5 结论
• 第3章 基于RNAi技术揭示轮虫的SIR2 基因对其寿命的调控作用
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 轮虫的培养
•     3.2.2 藻类的培养
•     3.2.3 主要实验仪器、试剂
•     3.2.4 实验设计
•     3.2.5 SIR2 双链RNA的合成
•     3.2.6 萼花臂尾轮虫SIR2 基因干扰
•     3.2.7 Sir2 基因干扰对轮虫寿命、基因表达的的影响
•   3.3 结果
•     3.3.1 槲皮素、饮食限制处理后轮虫寿命的变化
•     3.3.2 qRT-PCR检测20μM槲皮素和饮食限制处理后SIR2 mRNA的表达情况
•     3.3.3 SIR2 基因干扰效果检测
•     3.3.4 SIR2 基因干扰后,qRT-PCR检测其下游基因的表达变化
•     3.3.5 SIR2 基因干扰后,20μM槲皮素和饮食限制对轮虫寿命的影响
•   3.4 讨论
•   3.5 结论
• 第4章 在低温延长轮虫寿命中热力学效应和基因调控的相关研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 轮虫的培养
•     4.2.2 实验藻类的培养
•     4.2.3 主要实验仪器、试剂
•     4.2.4 实验设计
•   4.3 结果
•     4.3.1 不同温度对轮虫寿命的影响
•     4.3.2 间断低温处理对轮虫寿命的影响
•     4.3.3 低温处理对轮虫抗氧化性的影响
•     4.3.4 对TRP基因进行干扰后,低温对轮虫寿命的影响
•   4.4 讨论
•   4.5 结论
• 第5章 轮虫衰老过程中钙离子通路中SERCA基因表达的研究
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 轮虫的培养
•     5.2.2 实验藻类的培养
•     5.2.3 实验主要仪器与试剂
•     5.2.4 qRT-PCR检验SERCA基因在轮虫衰老过程中表达量的变化情况
•     5.2.5 轮虫蛋白质的提取及其浓度检测
•     5.2.6 丙二醛含量测定
•     5.2.7 钙离子含量测定
•     5.2.8 qRT-PCR检测衰老过程中SERCA基因表达变化
•     5.2.9 单个体生命表实验
•     5.2.10 游泳速度测定
•     5.2.11 硝苯地平对轮虫体内钙离子浓度的影响
•     5.2.12 硝苯地平预处理对轮虫丙二醛积累量的影响
•   5.3 结果
•     5.3.1 在轮虫生命不同阶段SERCA基因的表达量的变化
•     5.3.2 硝苯地平对轮虫存活率的影响
•     5.3.3 硝苯地平对轮虫游泳速率的影响
•     5.3.4 硝苯地平对轮虫体内钙离子含量以及脂质过氧化物丙二醛积累量的影响
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 第6章 亲代不同食物喂养方案、不同生产年龄对子寿命及体型大小的影响
•   6.1 引言
•   6.2 材料与方法
•     6.2.1 轮虫的培养
•     6.2.2 实验藻类的培养
•     6.2.3 实验主要仪器与试剂
•     6.2.4 生活史特征观察
•     6.2.5 轮虫体型测量
•   6.3 结果
• 0）生殖子代（F₁）年龄对子代寿命的影响'>    6.3.1 亲代（F₀）生殖子代（F₁）年龄对子代寿命的影响
•     6.3.2 饮食限制母体效应对后代寿命的影响
•     6.3.3 饮食限制对CR处理组所产子代寿命的影响
•     6.3.4 母体经历不同饮食方案对后代体型大小的影响
•   6.4 讨论
•   6.5 小结
• 2条件下压力防御基因表达量变化分析'>第7章 不同年龄组轮虫处于不同浓度CO₂条件下压力防御基因表达量变化分析
•   7.1 引言
•   7.2 材料与方法
•     7.2.1 轮虫的培养
•     7.2.2 实验藻类的培养
•     7.2.3 实验主要仪器与试剂
•     7.2.4 实验方案
•   7.3 结果
• 2气体对轮虫轮虫生命表参数的影响'>    7.3.1 高浓度CO₂气体对轮虫轮虫生命表参数的影响
• 2浓度对各年龄组48h存活率的影响'>    7.3.2 暴露于不同CO₂浓度对各年龄组48h存活率的影响
• 2气体后HSP70、CAT基因表达量的变化..'>    7.3.3 各年龄组暴露高浓度CO₂气体后HSP70、CAT基因表达量的变化..
•   7.4 讨论
•   7.5 小结
• 第8章 总结与展望
• 参考文献
• 在读期间发表的学位论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 田间

导师: 杨家新

关键词: 萼花臂尾轮虫,寿命,基因表达,母代效应

来源: 南京师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南京师范大学

基金: 国家自然科学基金(31772458,31272388),2015年江苏省研究生培养“创新工程”项目

分类号: Q953

DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.000871

总页数: 113

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