电化学/质谱法在生物分子分析中的应用

论文摘要

细胞是生物体的基本组成单位。鉴于细胞在形态、组分等方面均有较大个体差异性,在单细胞层面对细胞中生物分子的传感分析将有助于研究细胞层面的生命活动,如细胞的生长、分化、病变等。这些基于单细胞分析的研究结果对疾病的早期诊断和预防等均具有重要的指导意义。在过去50年中,对单个细胞中生物分子的检测技术已取得了长足发展,主要有光学分析、电化学分析、质谱检测和微流控技术等。本论文第一部分将基于电化学分析法免标记、检测限低及简便等优势,结合实验室建立的“单细胞试剂盒”分析策略,实现了对单个细胞内电化学难检分子——磷酸盐的检测。由于电化学无法直接得到传感过程的分子结构信息,本论文第二部分结合微毛细管特性设计了一种电化学和质谱在线联用的方法,利用质谱分析可以直接判定混合物组成的优势,获取生物分子在不同环境下进行氧化还原过程的分子结构,以探究化学反应机理。本论文第三部分进一步结合毛细管内试剂盒反应及质谱分析方法,实现对细胞色素C蛋白结构的解析,为单细胞蛋白组学的研究提供早期探索性数据。本文第一部分工作使用尖端开口～100nm毛细管,利用其扎入细胞过程中对细胞损伤小、毛细管内可留存试剂盒成分的特性,将转化磷酸盐所需的麦芽糖、麦芽糖磷酸化酶（MP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、变旋酶（MR）灌入毛细管内,通过管内电压梯度产生的电渗流作用,将管内溶液“注射”进细胞内。同时,在毛细管表面镀一层Pt金属层,并用PDMS侧面绝缘,保留尖端截面的圆环电极,直接检测细胞内反应的电信号。细胞内的磷酸盐和麦芽糖在MP作用下生成α-D-葡萄糖,经MR变旋后生成β-D-葡萄糖;随后在GOD作用下被氧化成H202,H2O2在圆环电极表面被氧化并产生电流,从而实现了细胞内磷酸盐的检测。此外,本章还对焦磷酸盐、聚磷酸盐、ATP等类磷酸盐进行对比分析,发现该法对于磷酸盐检测有很好的选择性;在扣除细胞内葡萄糖产生的信号后,可以准确地反应单个细胞中的磷酸盐水平。为了获取电化学分析过程中的分子结构信息,第二部分工作利用毛细管可以作为电化学分析池和质谱电喷雾发生器的特性,开发了一种结合电化学分析和质谱分析的在线分析装置;以多巴胺和双（二芳基亚甲基）型染料为模型,研究其在电化学分析中的分子结构转化信息。在毛细管内灌入不同pH下的反应物溶液,插入电极以实现在管内的电化学分析。同时,将毛细管尖端靠近质谱进样口,在管内电化学反应发生后,对管内电极施加高压,在毛细管尖端产生电喷雾,进入质谱口获取反应物和产物信息。该法成功实现了不同pH下的多巴胺的电氧化机理分析和双（二芳基亚甲基）型染料电转化机理研究,具有实时、快速、高灵敏度的优点。在毛细管内试剂盒反应及毛细管电喷雾质谱分析方法建立的基础上,本论文第三部分工作结合毛细管内试剂盒反应及电喷雾质谱,实现对管内细胞色素C的酶解分析,以确定其蛋白结构。毛细管内预存蛋白质酶解所需的尿素、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酸;在抽入胰酶（Trypsin）和细胞色素C后,蛋白质在尿素作用下暴露二硫键,进而被DTT氧化成巯基,继续被Trypsin切断,碘乙酸保护疏基抑制二硫键再生成,促使酶解不断进行。酶解完成后通过电喷雾质谱分析酶解产物肽段来对蛋白质组成进行分析。该法实现了对细胞色素C蛋白结构的解析,有望应用于单个细胞内蛋白质结构的分析。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 单细胞分析
•     1.1.1 单细胞分析的研究目的和意义
•     1.1.2 单细胞内磷酸盐
•     1.1.3 单细胞内蛋白质
•     1.1.4 单细胞分析方法
•     1.1.5 小结
•   1.2 生物分子化学反应机理的分析
•     1.2.1 生物分子化学反应分析的研究目的及其意义
•     1.2.2 多巴胺（Dopamine）氧化反应
•     1.2.3 双（二芳基亚甲基）型染料电转化反应
•     1.2.4 化学反应机理研究方法
•     1.2.5 小结
•   1.3 本论文的研究内容及目的
•   参考文献
• 第二章 单个活细胞中磷酸盐的电化学检测
•   2.1 前言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 试剂和仪器
•     2.2.2 细胞培养
•     2.2.3 纳米电极制备和表征
•     2.2.4 电化学分析检测
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 纳米电极制备与表征
•     2.3.2 磷酸盐溶液检测
•     2.3.3 单个活细胞中磷酸盐检测
•     2.3.4 小结
•   参考文献
• 第三章 电化学-质谱联用分析生物分子电化学反应分子机理
•   3.1 前言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 试剂和仪器
•     3.2.2 管内Pt电极的制备过程和表征方法
•     3.2.3 电化学工作站和质谱Nano-ESI在线联用装置
•   3.3 结果和讨论
•     3.3.1 毛细管内铂电极表面的电化学表征
•     3.3.2 毛细管内电化学-质谱分析多巴胺的电子转移过程
•     3.3.3 Pt电极应用于电化学质谱分析双（二芳基亚甲基）型染料电转化过程
•     3.3.4 小结
•   参考文献
• 第四章 毛细管电喷雾质谱法检测蛋白
•   4.1 前言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 试剂和仪器
•     4.2.2 离心管中Trypsin酶解细胞色素C实验
•     4.2.3 微毛细管中酶解蛋白实验
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 离心管中Trypsin酶解细胞色素C实验
•     4.3.2 微毛细管中Trypsin酶解细胞色素C实验
•     4.3.3 小结
•   参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨丹丹

导师: 江德臣

关键词: 电化学,质谱,单细胞,磷酸根离子,在线分析

来源: 南京大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 南京大学

分类号: O657;Q2-33

总页数: 73

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