高吉照1薛天阳1许伟1郭雷1李艳1
1徐州医学院附属医院儿科江苏徐州221002
摘要：目的探讨苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞株CyclinD1、Fas和凋亡的影响。方法对数生长期的人横纹肌肉瘤RD细胞株，不同浓度苦参碱（0、0.5、1.0、1.5mg/ml）分别作用48h后，RT-PCR法检测CyclinD1和FasmRNA的表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果RT-PCR结果显示，CyclinD1/β-actin比值分别为0.59±0.06、0.35±0.05、0.27±0.02、0.05±0.01，各实验组与对照组比较、实验组两两比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；FasmRNA的表达：对照组及各实验组的灰度值分别为：0.322±0.020、0.393±0.025、0.516±0.404、0.707±0.252，各实验组与对照组比较、实验组两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；流式细胞仪检测对照组及各实验组细胞凋亡率分别为（3.61±0.212）%、（8.70±0.232）%、（17.26±0.120）%、（29.52±0.348）%。各实验组与对照组比较、实验组两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论苦参碱能下调横纹肌肉瘤RD细胞的CyclinD1mRNA，上调FasmRNA，诱导横纹肌肉瘤RD细胞的凋亡。
关键词：苦参碱；横纹肌肉瘤；CyclinD1；FasmRNA；细胞凋亡
ABSTRACTObjectiveApproachtheeffectofmatrineonCyclinD1andFasofhuman
rhabdomyosarcomaRDcells.MethodsAffterthehumanrhabdomyosarcomaRDcellsline
treatedwithmatrineofdifferentconcentrations（0、0.5、1.0、1.5mg/ml）for48hours
respectively，theexpressionsofCyclinD1andFasmRNAwereexaminedbyRT-PCR，andcellsapoptosisrateswereexaminedbyflowcytometry（FCM）.ResultsTheresultsofRT-PCRshowedthatexpressionsofCyclinD1mRNAwere0.59±0.06，0.35±0.05、0.27±0.02、0.05±0.01，respectively（P＜0.01），FasmRNAwere0.322±0.020、0.393±0.025、0.516±0.404and0.707±0.252，respectively（P＜0.05）.Thetotalapoptosisrateswere（3.61±0.212）%、（8.70±0.232）%、（17.26±0.120）%、（29.52±0.348）%，respectively（P＜0.05）.ConclusionTheCyclinD1mRNAofRDcellsisdown-regulated，theFasmRNAisup-regulated，andtheapoptosisisinducedbymatrine.
KeywordsMatrine；Rhabdomyosarcoma；CyclinD1；FasmRNA；CellApoptosis
近年来，苦参碱（Matrine）的抗肿瘤作用越来越引起国内外学者的关注，然而，苦参碱抗肿瘤作用的相关机制仍不清楚，我们通过苦参碱作用于儿童软组织肿瘤中最常见、恶性度高的人横纹肌肉瘤RD细胞株，来探讨苦参碱抗肿瘤的作用机制。
1材料和方法
1.1材料人横纹肌肉瘤RD细胞株购自上海中科院细胞库，苦参碱购自陕西中鑫生物技术有限公司，总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物公司，PTC-200型PCR仪购自美国MJResearch公司，RT-PCR两步法试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，CyclinD1、Fas和β-内因子（β-actin）引物购自上海艾博思生物有限公司，CyclinD1、FAS单克隆抗体购自SantaCruz公司，CO2恒温培养箱购自美国LRBMODEL2300，FACS流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养和传代细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养瓶内，置37℃、5%CO2的培养箱中孵育，每2-3天换液一次，当细胞覆盖率达80-90%时，按1：3传代，取对数生长期的细胞进行试验。
1.2.2实验分组药物干预组：苦参碱浓度分别为0.5、1.0、1.5（mg/ml）；对照组：含等量细胞、培养液及稀释苦参碱的等量溶剂RPMI1640培养基，不加苦参碱。细胞6-12h贴壁，处理后继续培养48h，每组设5个复孔。
1.2.3RT-PCR法检测CyclinD1和Fas的表达每瓶细胞接种浓度为107个，贴壁，处理后收获细胞，Trizol提取试剂盒提取RNA，-80℃保存；按说明书步骤逆转录mRNA为cDNA；PCR扩增，CyclinD1引物上游序列为5'-GGAGCTGCTCCTGGTGAACA-3'，下游序列为5'-TGTTGGGGCTCCTCAGGTTCA-3'，扩增的目的片段长度为245bP；Fas引物上游序列为5'-GTCCAAAAGTGTTAATGCCCAAGT-3'，下游序列为5'-ATGGGCTTTGTCTGTGTACTCCT-3'，扩增的目的片段长度为232bP；β-actin引物上游序列为5'-TCACCACCACAGCCGAAAG-3'，下游序列为5'-GGTCAGCAATGCCAGGGT-3'，扩增的目的片段长度为300bP。将产物94℃变性2min，CyclinD154℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后一次循环72℃延伸10min；FasmRNA64℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后一次循环72℃延伸2min。终止反应后，产物于-20℃保存，1.5%琼脂糖-凝胶电泳，80V电泳40min；利用电脑成像统计泳带密度，通过密度分析测定目的基因产物与内参照基因产物的比率（PCR率），半定量分析目的基因的表达。
1.2.4FCM法检测细胞凋亡率收集细胞，PBS洗两遍并离心（2000rPm、5min），加入500μlBindingBuffer悬浮细胞，加入5μlAnnexin-V-FITC混匀，加入5μlPI，室温，避光，染色15min后，于1h内流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.3统计学处理：实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。各组间比较采用单因素方差分析法（One-wayANOVA），检验水准：α=0.05。
2结果
各组CyclinD1、FasmRNA表达和细胞凋亡率见表1。
表1各组CyclinD1、FasmRNA和细胞凋亡率
组别CyclinD1FasmRNA细胞凋亡率（%）
对照组0.59±0.060.322±0.0203.61±0.212
0.5mg/ml组0.35±0.05△0.393±0.025﹡8.70±0.232﹡
1.0mg/ml组0.27±0.02△0.516±0.404﹡17.26±0.120﹡
1.5mg/ml组0.05±0.01△0.707±0.252﹡29.52±0.348﹡
与对照组比较：△P＜0.01，﹡P＜0.05；实验组两两比较：△P＜0.01，﹡P＜0.05。
3.讨论
我们的实验结果显示，苦参碱（Matrine）作用于人横纹肌肉瘤RD细胞株后，RD细胞株凋亡率增加，CyclinD1下调，Fas上调，均存在浓度依赖性。
肿瘤的发生、发展和凋亡是一复杂过程，受许多因素影响，多种细胞因子和通路参与调控。以Cyclins/CDKs/CKI/PRb为核心的G1/S期细胞周期网络调控系统是肿瘤发生中最常改变的共同通路[1、2]，调控G1/S期限制点的各细胞周期调节因子，成了肿瘤相关DNA病毒所产生的致瘤蛋白活化细胞周期的靶子。其中，CyclinD1与肿瘤关系最为密切，在多种恶性肿瘤中均高表达，与肿瘤的发生、发展及对化疗药物的反应均有密切的关系[3、4]。下调CyclinD1能起到促进肿瘤细胞凋亡，抑制增殖的目的[5、6]。Fas则是重要的细胞凋亡启动基因，其基因表达产物属于肿瘤坏死因子受体家族，Fas与相应配体结合后，通过其胞内段的死亡域与胞浆内含有死亡域的Fas相关蛋白（Fasassociatedproteinwithdeathdomain，FADD）分子羧基端的死亡域相互作用，FADD的氨基端含有死亡效应域（deatheffectordomain，DED），该区域可与Caspase-8酶原的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas区域。Fas、FADD和Caspase-8形成凋亡诱导信号复合体，引起Caspase-8激活，最终将在细胞内以无活性的酶原形式存在的Caspase-8前体（ProcasPase3）活化、进一步剪切为活性片段而诱导细胞凋亡[7～11]。
苦参碱是豆科槐属植物苦参中所含的一种生物碱，具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗心律失常、免疫抑制、中枢抑制等多种药理作用[12]。近年来的研究表明，苦参碱能通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡而发挥抗肿瘤作用[13-15]，且因其毒副作用远小于常规化疗药物而备受关注，但其抗肿瘤的作用机制尚不清楚。
我们认为，苦参碱下调CyclinD1，使RD细胞株停留在G0/G1期，细胞增殖受阻，同时上调Fas，启动细胞凋亡通路，加速细胞凋亡，是其抗肿瘤作用的机制之一，这种作用随着苦参碱浓度的增加而增加。
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