猪胸膜肺炎放线杆菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

论文摘要

为实现对猪胸膜肺炎的致病菌猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）的量化研究,本实验根据猪胸膜肺炎放线杆菌特异性基因ApxⅣ的保守序列,设计引物探针,通过优化反应条件,建立可对其准确定量的微滴数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性以及适用性进行验证,与实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qPCR）检测方法进行比较分析。结果表明:ddPCR最佳退火温度为52℃;线性相关系数（R2）为0.9957,线性关系良好;灵敏度达153.8copies/μL,是qPCR的两倍;特异性良好,与其它常见猪病原无交叉反应。在实际样品检测中,110份样品的ddPCR与qPCR检测结果的Kappa系数为0.9529,说明两种检测方法结果高度一致,并且ddPCR可对qPCR无法判断阴阳性的可疑样本进行定量分析。本实验建立的ddPCR方法敏感性高、特异性强、可用于猪胸膜肺炎放线杆菌的定量检测。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 细菌与病毒
•     1.1.2 仪器
•     1.1.3 试剂
•     1.1.4 样品
•   1.2 方法
•     1.2.1 引物和探针的设计
•     1.2.2 核酸的提取
•     1.2.3 APP标准品的制备
•     1.2.4 APP实时荧光PCR体系的建立
•     1.2.5 dd PCR反应体系和条件优化
•     1.2.6 特异性实验
•     1.2.7 灵敏度和重复性实验
•     1.2.8 实际样本检测
• 2 结果与讨论
•   2.1 q PCR方法的建立
•   2.2 dd PCR反应条件的确定
•   2.3 重复性和灵敏度试验结果
•   2.4 标准曲线和最低检测限
•   2.5 特异性分析
•   2.6 临床样本检测
• 3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 石磊,刘雨琦,陈洵,叶蕾,常彦磊,李丽丽

关键词: 猪胸膜肺炎放线杆菌,微滴数字,检测方法

来源: 现代食品科技 2019年03期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 暨南大学食品安全与营养研究院

基金: 国家重点研发计划重点专项(2016YFD0500600),广东省科技计划项目(2017B020207004),中央高校基本科研业务费项目(2017MS104,21618309)

分类号: S852.61

DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.3.032

页码: 212-217

总页数: 6

文件大小: 1386K

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