亚洲1型口蹄疫疫苗毒株的自然重组株生物学特性研究

论文摘要

口蹄疫被OIE列为法定上报的动物疫病,是国际贸易关注的重要疫病之一,其对经济和政治影响巨大。为有效防控口蹄疫,不同国家和地区根据国情及口蹄疫流行情况采取扑杀或疫苗免疫结合扑杀的措施,我国采用疫苗免疫结合扑杀的综合防控措施。为保证口蹄疫防控效果,疫苗产品质量至关重要。本研究针对口蹄疫亚洲1型疫苗种毒培养、产品质量检验过程中发生的异常展开研究,旨在为种毒监测、产品质量控制提供新的思路。研究发现口蹄疫病毒Asia-1/HN/06在适应无血清悬浮培养BHK-21细胞后VP1基因的3’末端（即第619位核苷酸后）有12nt插入（GTTGACTTAGTA,编码VDLV）。高通量测序证实病毒在无血清悬浮培养BHK-21细胞第4代发生插入变异,并且变异病毒所占比例随病毒传代逐渐增加。通过蚀斑克隆分离出含12nt插入变异毒株,命名为Vac-Asia-1-VDLV。为确定12nt插入序列的来源,通过核苷酸序列Blast分析及宿主细胞转录组测序,确定该序列来源于BHK-21细胞mRNA。通过对样品reads数据库分析,BHK-21细胞转录组中有3条mRNA含12nt相同序列,结合侧翼匹配序列长度、RNA重组机制以及mRNA变化水平分析,其中secernin-3蛋白的编码基因表达量明显高于对照组,并且该mRNA含有与12nt及两翼最长匹配序列,其作为供体与病毒重组的可能性最高。生物学特性研究结果表明Vac-Asia-1-VDLV病毒在BHK-21细胞中蚀斑形态变化不明显,可在CHO-K1及衍生细胞中生长,病毒滴度超过1×105PFU/mL。而Asia-1/HN/06在CHO系列细胞中感染率极低,没有蚀斑。表明Vac-Asia-1-VDLV能感染缺失整联蛋白及HS受体的细胞,可利用第三类受体。经反向遗传操作将编码VDLV的12nt序列插入到病毒O/CHA/90,结果表明其蚀斑形态、生长曲线及对CHO-K1系列细胞感染特性与亲本株O/CHA/90病毒相比无明显变化,说明12nt插入序列对病毒在BHK-21细胞的生长特性影响不大,对病毒利用第三类受体影响有限。病毒对乳鼠的半数致死量(LD50)及对牛的致病力结果显示Vac-Asia-1-VDLV及Asia-1/HN/06病毒对乳鼠的致病力差异不明显而对牛的致病力差异较大。Vac-Asia-1-VDLV病毒接种的3头牛均未出现临床症状及体温升高情况,未出现明显病毒血症。Asia-1/HN/06病毒接种牛表现出明显的口蹄疫症状并有体温反应,出现明显的病毒血症和排毒现象。表明Vac-Asia-1-VDLV对牛的致病力明显减弱,分析原因为RGD突变为GGD以及12nt插入序列影响了Asia-1型口蹄疫病毒对牛的致病力。综上所述,本研究首次报道了宿主细胞mRNA与口蹄疫病毒发生重组,通过转录组测序分析了供体mRNA来源,研究了重组病毒受体利用情况及对本动物致病力等的影响,丰富了口蹄疫遗传变异内容。本研究中亚洲1型口蹄疫病毒适应细胞产生的变异对免疫效果影响很大,也为口蹄疫疫苗生产中种毒监测的必要性提供了充分证据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 国内外研究进展
•     1.1.1 口蹄疫病毒
•     1.1.2 亚洲1型口蹄疫流行病学
•     1.1.3 口蹄疫病毒变异与进化
•     1.1.4 口蹄疫病毒变异对病毒特性的影响
•     1.1.5 口蹄疫病毒变异与免疫防控
•   1.2 研究目的和意义
•   1.3 研究思路和主要内容
•     1.3.1 研究线路图
•     1.3.2 主要内容
• 第二章 亚洲1型口蹄疫病毒Asia-1/HN/06在悬浮培养过程中发生插入突变
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 口蹄疫病毒毒株与细胞
•     2.1.2 仪器设备
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要溶液配制
•     2.1.5 两批疫苗免疫血清抗体效价测定
•     2.1.6 亚洲1型口蹄疫制苗种毒测序
•     2.1.7 不同代次制苗种毒追踪测序
•     2.1.8 VP1基因扩增子高通量测序
•     2.1.9 亚洲1型口蹄疫病毒悬浮培养病毒（F21代）蚀斑克隆纯化
•     2.1.10 三株亚洲1型口蹄疫病毒全基因组测序
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 两批亚洲1型口蹄疫疫苗免疫牛血清阻断ELISA效价差异不明显
•     2.2.2 亚洲1型口蹄疫病毒疫苗生产毒F21代VP1基因测序表明为变异毒株混合体
•     2.2.3 亚洲1型口蹄疫病毒在悬浮培养过程中发生了插入突变
•     2.2.4 亚洲1型口蹄疫插入变异病毒在无血清悬浮培养中随传代所占比例逐渐增加
•     2.2.5 克隆纯化分离出亚洲1型口蹄疫插入变异毒株Vac-Asia-1-VDLV
•     2.2.6 Vac-Asia-1-VDLV毒株与亲本株全基因组序列相比存在多个位点差异
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第三章 转录组测序确定亚洲1型口蹄疫病毒插入序列来源于宿主细胞BHK-21
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 材料
•     3.1.2 试剂
•     3.1.3 无血清悬浮BHK-21细胞转录组测序
•     3.1.4 无血清悬浮BHK-21细胞转录组测序结果分析
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 细胞转录组测序数据质量符合要求
•     3.2.2 两种培养方式BHK-21转录组测序比对结果统计无明显差异
•     3.2.3 比对区域分布基本一致
•     3.2.4 Reads在染色体上的密度分布相关性明显
•     3.2.5 基因差异表达分析184个基因存在显著差异
•     3.2.6 差异基因GO富集分析
•     3.2.7 BHK-21悬浮细胞中含特异12nt插入序列的mRNA
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第四章 口蹄疫Vac-Asia-1-VDLV毒株生物学特性研究
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 病毒与细胞株
•     4.1.2 主要试剂与仪器
•     4.1.3 实验动物
•     4.1.4 主要溶液的配制
•     4.1.5 病毒形态学及生长曲线测定
•     4.1.6 病毒利用细胞受体测定
•     4.1.7 多肽封闭病毒感染细胞试验
•     4.1.8 病毒感染乳鼠试验
•     4.1.9 病毒感染牛试验
•     4.1.10 亚洲1型口蹄疫病毒结构蛋白抗体ELISA效价及血清交叉中和效价测定
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 病毒Vac-Asia-1-VDLV与Asia-1/HN/06的蚀斑形态学及生长曲线存在差异
•     4.2.2 Vac-Asia-1-VDLV毒株可利用第三类受体感染细胞
•     4.2.3 多肽不能抑制Vac-Asia-1-VDLV病毒感染BHK-21细胞
•     4.2.4 Vac-Asia-1-VDLV毒株对乳鼠致病力与亲本毒株Asia-1/HN/06无明显差异
•     4.2.5 Vac-Asia-1-VDLV毒株对牛致病力明显减弱
•     4.2.6 Vac-Asia-1-VDLV接种牛康复血清交叉中和Asia-1/HN/06病毒r值显著下降
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 第五章 O型口蹄疫病毒VP1基因3’末端插入12nt外源序列对病毒的生长特性影响不明显
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 病毒与细胞株
•     5.1.2 主要试剂及仪器设备
•     5.1.3 主要溶液的配制
•     5.1.4 O型口蹄疫病毒VP1基因插入12nt序列感染性克隆构建
•     5.1.5 O/CHA/90-VDLV蚀斑形态及遗传稳定性测定
•     5.1.6 O/CHA/90-VDLV生长曲线测定
•     5.1.7 O/CHA/90-VDLV感染BHK-21及CHO-K1及衍生细胞试验
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 成功构建O/CHA/90-VDLV感染性克隆并拯救病毒
•     5.2.2 O/CHA/90-VDLV蚀斑形态与遗传稳定性分析
•     5.2.3 O/CHA/90-VDLV与O/CHA/90生长曲线无明显差异
•     5.2.4 O/CHA/90-VDLV不能感染CHO-K1及衍生细胞系
•   5.3 讨论
•   5.4 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 邹兴启

导师: 朱鸿飞

关键词: 口蹄疫病毒,宿主细胞,重组,生物学特性,致病力

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.65

总页数: 103

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