论文摘要
肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析(1)绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列(AF019622.1),采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1(+)载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;(2)RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。(3)RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得(1)供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显著,但两者的桑/囊胚率差异不显著(分别为24.1%和15.6%);供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。(2)重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合(一次一个)的融合方式能显著提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合(一次多个)方法比差异不显著;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定(1)重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎(242枚)移植到同步发情的受体绵羊(23只)体内,以检验其在体内的发育能力。(2)转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得(1)Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;(2)肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;(3)Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;(4)通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
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摘要Abstract1 绪论 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) 1.1.1 MSTN基因的发现 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 1.1.3 MSTN基因的表达 1.1.4 MSTN的作用机制 1.1.5 MSTN的表达调控机制 1.1.6 MSTN基因的应用前景 1.2 RNA干涉 1.2.1 RNA干涉现象的发现 1.2.2 RNA干涉的作用机制 1.2.3 RNA干涉的作用特点 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 1.2.6 RNA干涉的应用前景 1.3 卵母细胞的体外成熟 1.3.1 卵母细胞的成熟 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 1.4 哺乳动物细胞核移植 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 1.4.6 核移植存在的问题 1.5 CRISPR/Cas9 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 1.5.2 Cas9蛋白的结构 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 1.6 研究的目的与意义2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 2.1 材料与方法 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 2.1.2 实验载体信息 2.1.3 药品和试剂 2.1.4 溶液的配制 2.1.5 主要仪器设备 2.2 实验方法 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 2.3 结果 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 2.4 讨论 2.5 本章小结3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 3.1.2 主要药品和试剂 3.1.3 溶液配制 3.1.4 主要仪器设备 3.2 实验方法 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 3.2.3 G418浓度的筛选 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 3.3 实验结果 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 3.3.2 最适G418浓度的筛选 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 3.4 讨论 3.5 本章小结4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 4.1 实验材料 4.1.1 实验动物 4.1.2 药品试剂 4.1.3 溶液配制 4.1.4 仪器设备 4.2 实验方法 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 4.2.5 显微操作前的实验准备 4.2.6 核供体细胞的准备 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 4.2.9 重构胚的融合与激活 4.2.10 重构胚的体外培养 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 4.2.12 转基因胚胎的移植 4.2.13 数据统计 4.3 结果 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 4.4 讨论 4.4.1 卵巢的保存和运输 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 4.4.5 转基因动物的生产 4.5 本章小结5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 5.1 实验材料 5.1.1 实验动物和菌株 5.1.2 实验载体信息 5.1.3 药品和试剂 5.1.4 溶液的配制 5.1.5 主要仪器设备 5.2 实验方法 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 5.3 结果 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 5.4 讨论 5.5 本章小结结论参考文献附录攻读学位期间发表的学术论文致谢
文章来源
类型: 博士论文
作者: 李昊
导师: 安铁洙
关键词: 基因,基因敲低,克隆,绵羊
来源: 东北林业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 东北林业大学
分类号: S826;Q78
DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000054
总页数: 180
文件大小: 16544K
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标签:基因论文; 基因敲低论文; 克隆论文; 绵羊论文;