Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究

论文摘要

肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显著,但两者的桑/囊胚率差异不显著（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显著提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显著;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）
•     1.1.1 MSTN基因的发现
•     1.1.2 MSTN基因和蛋白结构
•     1.1.3 MSTN基因的表达
•     1.1.4 MSTN的作用机制
•     1.1.5 MSTN的表达调控机制
•     1.1.6 MSTN基因的应用前景
•   1.2 RNA干涉
•     1.2.1 RNA干涉现象的发现
•     1.2.2 RNA干涉的作用机制
•     1.2.3 RNA干涉的作用特点
•     1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点
•     1.2.5 哺乳动物的RNA干涉
•     1.2.6 RNA干涉的应用前景
•   1.3 卵母细胞的体外成熟
•     1.3.1 卵母细胞的成熟
•     1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制
•     1.3.3 卵母细胞成熟的特征
•     1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素
•   1.4 哺乳动物细胞核移植
•     1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展
•     1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展
•     1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展
•     1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展
•     1.4.5 影响细胞核移植结果的因素
•     1.4.6 核移植存在的问题
•   1.5 CRISPR/Cas9
•     1.5.1 CRISPR/Cas9的发现
•     1.5.2 Cas9蛋白的结构
•     1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制
•     1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战
•   1.6 研究的目的与意义
• 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验动物、细胞和菌株
•     2.1.2 实验载体信息
•     2.1.3 药品和试剂
•     2.1.4 溶液的配制
•     2.1.5 主要仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析
•     2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建
•     2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建
•     2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养
•     2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测
•     2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射
•   2.3 结果
•     2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析
•     2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建
•     2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序
•     2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染
•     2.3.5 RNA干涉效率结果与分析
•     2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验动物
•     3.1.2 主要药品和试剂
•     3.1.3 溶液配制
•     3.1.4 主要仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 RNA干涉载体的线性化
•     3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养
•     3.2.3 G418浓度的筛选
•     3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选
•     3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定
•     3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存
•     3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养
•     3.3.2 最适G418浓度的筛选
•     3.3.3 转基因细胞的生物学特征
•     3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定
•     3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验动物
•     4.1.2 药品试剂
•     4.1.3 溶液配制
•     4.1.4 仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 绵羊卵母细胞的获取
•     4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟
•     4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活
•     4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏
•     4.2.5 显微操作前的实验准备
•     4.2.6 核供体细胞的准备
•     4.2.7 核受体卵母细胞的准备
•     4.2.8 卵母细胞的去核和注核
•     4.2.9 重构胚的融合与激活
•     4.2.10 重构胚的体外培养
•     4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定
•     4.2.12 转基因胚胎的移植
•     4.2.13 数据统计
•   4.3 结果
•     4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响
•     4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响
•     4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响
•     4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响
•     4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响
•     4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响
•     4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响
•     4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响
•     4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响
•     4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定
•     4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定
•   4.4 讨论
•     4.4.1 卵巢的保存和运输
•     4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养
•     4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理
•     4.4.4 重构胚的融合、激活和培养
•     4.4.5 转基因动物的生产
•   4.5 本章小结
• 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 实验动物和菌株
•     5.1.2 实验载体信息
•     5.1.3 药品和试剂
•     5.1.4 溶液的配制
•     5.1.5 主要仪器设备
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得
•     5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测
•     5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建
•     5.2.4 小鼠胚胎的显微注射
•     5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测
•     5.2.6 胚胎移植和基因分型检测
•   5.3 结果
•     5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测
•     5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建
•     5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得
•     5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得
•     5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得
•   5.4 讨论
•   5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李昊

导师: 安铁洙

关键词: 基因,基因敲低,克隆,绵羊

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北林业大学

分类号: S826;Q78

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000054

总页数: 180

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