抗菌海洋放线菌的筛选及其次级代谢物的分离与结构解析

论文摘要

放线菌是多种生物活性天然产物的潜在来源,在微生物药物开发中具有重要的作用。海洋放线菌由于其特殊的生长环境造成了与陆地放线菌不同的代谢途径,能够产生具有生物活性的天然产物,是天然药用化合物的重要生产者。从不同海洋环境中筛选放线菌,并对其次级代谢产物分离提取寻找生物活性物质具有重要意义。本文通过对日照海岸线海洋沉积物中放线菌的筛选,揭示了日照海岸线放线菌的分布、抑菌潜力及其多样性。主要研究结果如下:（1）采用五种不同的筛选培养基以及五种不同的预处理方法进行放线菌的筛选一共得到208株放线菌。牛津杯法被用来检测抑菌活性,其中91株具有抑菌活性。35株对产气杆菌（Aerobacter aerogenes）CGMCC 1.183有抑制作用,25株对变形杆菌（Proteus）CGMCC 1.491有抑制作用,17株对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923有抑制作用,9株对大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922有抑制作用,2株对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CGMCC 1.15148有抑制作用,3株对黄曲霉（Aspergillus flavus）CGMCC 3.3950有抑制作用。然后,选取25株抗菌活性较好的菌株,以16S rRNA基因为基础,对其进行系统进化研究,25株菌可以分为22个种,属于三个不同的属:链霉菌属（18株）,拟诺卡氏菌属（4株）和糖单胞菌属（3株）。（2）通过单因素实验确定了海洋灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens）SSGRZ-F8菌株最佳发酵条件。在此实验中结果表明菌株SSGRZ-F8产抑菌活性物质的最佳培养时间为11天,最佳接种量为8%,最佳培养温度为30℃,最佳初始pH为8。通过发酵条件的优化,菌株SSGRZ-F8对金黄色葡萄球菌、产气杆菌以及变形杆菌的抑菌圈直径分别提高了8 mm、12 mm、7 mm。同时进行了菌株所产抑菌活性物质性质的研究,发现抑菌活性物质具有较好的酸碱稳定性、热稳定性、光照稳定性以及遗传稳定性。（3）运用葡聚糖凝胶LH-20柱层析、反向MPLC以及HPLC等分离方法从发酵液有机相中分离得到5个单体化合物。利用一维核磁、二维核磁以及LC-MS鉴定五个化合物分别为:化合物1[cyclo（L-Val-L-Pro）]、化合物2[cyclo（L-Pro-L-Leu）]、化合物3[cyclo（L-Pro-L-Tyr）]、化合物4（N-acetyltyramine）、化合物5[cyclo（L-Pro-L-Phe）]。运用732阳离子交换树脂、AB-8大孔树脂以及葡聚糖凝胶G-25柱层析等分离方法从发酵液水相中得到复合物Z3.（4）对化合物1-5和复合物Z3进行了生物活性的测定,结果表明化合物3对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、产气杆菌的最小抑菌浓度分别是160μg/mL、120μg/mL、100μg/mL,化合物5对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、产气杆菌的最小抑菌浓度分别是180μg/mL、150μg/mL、130μg/mL,复合物Z3对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、产气杆菌的最小抑菌浓度分别是100μg/mL、30μg/mL、20μg/mL。同时还发现化合物1、2、3、5能够抑制A549细胞的侵袭与迁徙。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 海洋放线菌概述
•   1.2 海洋放线菌次级代谢产物
•     1.2.1 概述
•     1.2.2 种类和活性
•   1.3 放线菌筛选研究
•     1.3.1 概述
•     1.3.2 影响放线菌筛选的因素
•   1.4 本论文的选题依据及主要研究内容
• 第二章 海洋放线菌的筛选与鉴定
•   2.1 前言
•   2.2 材料与设备
•     2.2.1 指示菌
•     2.2.2 试剂
•     2.2.3 培养基
•     2.2.4 实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 样品的采集
•     2.3.2 放线菌的筛选
•     2.3.3 抑菌活性测试
•     2.3.4 放线菌多样性分析
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 可培养放线菌的筛选
•     2.4.2 放线菌的抑菌作用
•     2.4.3 放线菌多样性分析
•   2.5 小结
• 第三章 海洋灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens）SSGRZ-F8发酵条件的优化及其抑菌活性物质的研究
•   3.1 前言
•   3.2 材料与设备
•     3.2.1 菌种
•     3.2.2 试剂
•     3.2.3 培养基
•     3.2.4 仪器与设备
•   3.3 试验方法
•     3.3.1 菌株F8的鉴定
•     3.3.2 菌株的活化
•     3.3.3 种子液的制备
•     3.3.4 抑菌活性的测定
•     3.3.5 发酵条件的优化
•     3.3.6 抑菌活性物质稳定性研究
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 菌株F8的鉴定
•     3.4.2 培养时间对抑菌作用的影响
•     3.4.3 接种量对抑菌效果的影响
•     3.4.4 不同发酵温度对抑菌效果的影响
•     3.4.5 发酵液的初始pH对抑菌效果的影响
•     3.4.6 发酵条件优化前后抑菌效果比较
•     3.4.7 抑菌活性物质的pH稳定性
•     3.4.8 抑菌活性物质的热稳定性
•     3.4.9 抑菌活性物质的光照稳定性
•     3.4.10 抑菌活性物质的遗传稳定性
•   3.5 小结
• 第四章 海洋灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens）SSGRZ-F8次级代谢产物的分离纯化
•   4.1 前言
•   4.2 材料与设备
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验仪器
•     4.2.3 培养基
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 显色剂的配制
•     4.3.2 葡聚糖凝胶柱层析（Sephadex LH-20）
•     4.3.3 中压液相柱层析（LiChroprep RP-18,100A,40-63μm）
•     4.3.4 732阳离子交换树脂层析
•     4.3.5 AB-8大孔树脂层析
•     4.3.6 葡聚糖凝胶G-25 柱层析
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 粗体物的制备
•     4.4.2 甲醇提取物的分离纯化
•     4.4.3 水相次级代谢产物的分离纯化
•   4.5 小结
• 第五章 化合物结构的解析及生物活性测定
•   5.1 前言
•   5.2 材料与设备
•     5.2.1 实验材料
•     5.2.2 实验仪器
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 化合物核磁共振分析
•     5.3.2 化合物质谱分析
•     5.3.3 化合物和复合物Z3 最小抑菌浓度的测定
•     5.3.4 化合物细胞毒性实验
•     5.3.5 细胞侵袭与迁徙实验
•   5.4 结果与分析
•     5.4.1 化合物结构的鉴定
•     5.4.2 最小抑菌浓度
•     5.4.3 细胞毒性实验
•     5.4.4 侵袭与迁徙实验
•   5.5 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 梁光杰

导师: 杨革

关键词: 海洋放线菌,次级代谢产物,分离纯化,结构解析,生物活性

来源: 曲阜师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 曲阜师范大学

分类号: Q936

总页数: 63

文件大小: 5660K

下载量: 152