芽孢缺失型地衣芽孢杆菌自溶基因敲除的研究

论文摘要

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是酶制剂行业重要的工业生产菌株之一,可以发酵生产包括α-淀粉酶在内的多种酶制剂产品。地衣芽孢杆菌在发酵产酶过程中,尤其是在发酵中后期,易形成芽孢同时伴随碱性蛋白酶的生成,影响目标酶的稳定积累;另外,地衣芽孢杆菌生长过程中存在自溶现象,在芽孢缺失菌中,自溶现象更加明显,不利于菌体的高密度发酵,最终影响菌体及目标酶的发酵生产。因此,利用基因敲除的方法降低地衣芽孢杆菌的芽孢生成率及菌体自溶率,有利于目标酶的发酵生产,是一种新的工业微生物育种手段。芽孢形成以及菌体自溶受多种基因调控,本研究以B.licheniformis DL-1为出发菌株,α-淀粉酶作为目标酶,分别选取了与B.licheniformis DL-1芽孢形成相关基因spoⅡQ及菌体自溶相关基因pcf作为目标基因进行敲除,分析上述两个基因缺失后对地衣芽孢杆菌芽孢生成率、菌体自溶率以及菌体发酵性能等的影响,主要结果如下:1、利用基因无痕敲除技术,以pTOPO-Cmr作为基因敲除载体,构建了重组载体pTOPO-Cmr-spoⅡQ,对地衣芽孢杆菌芽孢生成中期调控基因spoⅡQ进行敲除,获得重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ,结果显示,出发菌与重组菌芽孢生成率分别为79.82%、0.16%,表明spoⅡQ基因的缺失使得B.licheniformis DL-1菌体芽孢生成率大幅降低,但重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ菌体自溶现象更加明显,与出发菌株B.licheniformis DL-1相比,菌体浓度降低39.7%,α-淀粉酶、碱性蛋白酶酶活分别降低13.1%与28.5%。通过营养条件控制,可以使B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ菌体自溶率降低52.6%,在一定程度上改善菌体自溶现象。研究证明,敲除spoⅡQ基因可以降低地衣芽孢杆菌芽孢生成率,但重组菌的菌体自溶现象需要进一步解决。2、根据同源单交换原理,在芽孢缺失重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ的基础上,利用重叠PCR技术将pcf片段与Cmr片段连接并电转化至重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ,获得重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf,重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ与重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf在LB培养基培养,发现重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf较重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ菌体自溶率降低11.2%,结合营养条件控制与自溶基因pcf敲除使得菌体自溶率最大降低了71.2%;由于菌体生物量的积累,摇瓶发酵重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf,α-淀粉酶、碱性蛋白酶酶活分别为434U/mL、94 U/mL,较重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ分别提高了27.5%及17.6%,同时α-淀粉酶酶活较出发菌株B.licheniformis DL-1提高了10.9%,碱性蛋白酶较出发菌B.licheniformisDL-1降低了16.1%。5 L发酵罐发酵显示出发菌B.licheniformis DL-1与重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcfα-淀粉酶最大酶活分别为1247 U/mL、1488 U/mL,其中重组菌较出发菌α-淀粉酶酶活提高了19.3%,较摇瓶发酵分别提高了3.2倍与3.4倍。结果表明,spoⅡQ基因缺失,可以减少芽孢杆菌碱性蛋白酶的分泌。在芽孢缺失的基础上,pcf基因缺失可以控制菌体自溶率,提高发酵生物量以及目标酶的发酵产量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 地衣芽孢杆菌的概述
•     1.1.1 地衣芽孢杆菌简介
•     1.1.2 地衣芽孢杆菌及其代谢产物的应用
•     1.1.3 地衣芽孢杆菌的研究现状
•   1.2 芽孢及其形成机制分析
•     1.2.1 芽孢介绍
•     1.2.2 芽孢形成过程及影响因素
•     1.2.3 芽孢形成过程中关键基因的调控
•   1.3 菌体细胞自溶机制分析
•     1.3.1 影响菌体细胞自溶因素
•     1.3.2 芽孢杆菌菌体自溶关键基因调控
•   1.4 立题背景和研究内容
•     1.4.1 立体背景
•     1.4.2 研究内容
• 第2章 敲除spoⅡQ基因对地衣芽孢杆菌产芽孢及发酵性能的影响
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌种和质粒
•     2.2.2 主要药品与试剂
•     2.2.3 主要仪器
•     2.2.4 主要溶液及缓冲液
•     2.2.5 主要培养基
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 B.licheniformis DL-1 最适氯霉素浓度的选择
•     2.3.2 B.licheniformis DL-1 基因组DNA的提取
•     2.3.3 pTOPO-Cmr质粒DNA的提取
•     2.3.4 引物设计
•     2.3.5 spoⅡQ敲除基因的制备
•     2.3.6 spoⅡQ基因敲除载体的制备与鉴定
•     2.3.7 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ的构建
•     2.3.8 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ的筛选与鉴定
•     2.3.9 出发菌与重组菌菌体形态观察
•     2.3.10 芽孢生成率的测定
•     2.3.11 生长曲线的测定
•     2.3.12 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ生长培养基的优化
•     2.3.13 α-淀粉酶酶活的测定
•     2.3.14 碱性蛋白酶酶活的测定
•   2.4 实验结果与讨论
•     2.4.1 B.licheniformis DL-1 氯霉素抗性实验
•     2.4.2 B.licheniformis DL-1 基因组提取
•     2.4.3 spoⅡQ敲除基因的制备
•     2.4.4 重组质粒的构建、转化以及鉴定
•     2.4.5 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ的构建及鉴定
•     2.4.6 出发菌及重组菌菌体形态观察
•     2.4.7 出发菌与重组菌芽孢生成率及生长曲线测定结果分析
•     2.4.8 营养条件对B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ菌体自溶影响
•     2.4.9 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQ发酵产酶结果分析
•   2.5 本章小结
• 第3章 敲除pcf基因对地衣芽孢杆菌菌体自溶及发酵性能的影响
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌种和质粒
•     3.2.2 主要药品与试剂
•     3.2.3 主要仪器
•     3.2.4 主要溶液与缓冲液
•     3.2.5 主要培养基
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 p HT01质粒的提取
•     3.3.2 引物的设计
•     3.3.3 同源重组片段pcf-Cmr的制备
•     3.3.4 同源重组片段pcf-Cmr产物的酶切及浓缩
•     3.3.5 重组菌B. licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf的构建
•     3.3.6 重组菌B. licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf的筛选及鉴定
•     3.3.7 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf菌体形态观察
•     3.3.8 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf生长曲线的测定
•     3.3.9 营养条件对B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf生物量的影响
•     3.3.10 重组菌与出发菌发酵性能的测定
•   3.4 实验结果与讨论
•     3.4.1 pHT01质粒的提取结果
•     3.4.2 pcf-Cmr重组片段的制备
•     3.4.3 pcf-Cmr同源重组片段的转化与重组菌的鉴定
•     3.4.4 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf菌体形态的观察
•     3.4.5 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf生长曲线测定结果
•     3.4.6 营养条件对B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf菌体生物量的影响
•     3.4.7 重组菌B.licheniformis DL-1ΔspoⅡQΔpcf发酵性能结果分析
•   3.5 本章小结
• 第4章 全文总结
• 第5章 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间主要科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张虎

导师: 肖静

关键词: 地衣芽孢杆菌,基因敲除,芽孢形成率,菌体自溶率,淀粉酶

来源: 齐鲁工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 齐鲁工业大学

分类号: Q78;TQ925

总页数: 77

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