山西地区猫杯状病毒的分离鉴定

论文摘要

猫杯状病毒（FCV）是一种高度传染性的病原体,可引起猫科动物口腔和上呼吸道疾病。本研究从山西地区疑似感染FCV的病猫采集鼻咽拭子进行病毒的分离,并对所分离毒株进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,获得4株FCV毒株。在此基础上分别对4个分离株进行噬斑纯化,电镜下观察纯化病毒粒子,并测定其半数感染量(TCID50),最后进行动物感染试验。本试验首先将鼻咽拭子无菌化处理后的液体,接种于F81单层细胞,盲传3代之后,出现典型的FCV的细胞病变效应,从采集的12份鼻咽拭子中,成功分离到4株FCV毒株,命名为CH-SX1、CH-SX2、CH-SX3、CH-SX4。通过分析GenBank中发表的FCV序列,在ORF1高度保守区设计1对引物,用于FCV毒株的鉴定,用FCV特异性引物对有病变效应的细胞培养物进行RT-PCR鉴定,均扩增出与理论值大小相符的DNA片段,表明4个分离株均为FCV。将经RT-PCR鉴定阳性的4株FCV毒株的细胞培养物,经过5轮噬斑纯化试验,分别获得4株纯化的FCV分离株。用0.5%磷钨酸对经噬斑纯化的细胞培养物上清进行负染,电镜观察,可见直径约35 nm的圆形、无囊膜、衣壳是正二十面体结构的病毒粒子,其与杯状病毒科的典型结构特征一致。将经噬斑纯化的4个分离毒株分别进行了TCID50的测定,4株分离毒株的TCID50分别为:CH-SX1,10-7.1;CH-SX2,10-7.2;CH-SX3,10-6.5;CH-SX4,10-8.3。为了进一步鉴定分离毒株是否为FCV,通过间接免疫荧光分析感染分离毒株的F81细胞,间接免疫荧光试验结果显示,4个分离毒株与均与FCV阳性血清反应,在荧光显微镜下可看到特异性绿色荧光,而阴性对照组看不到荧光,说明4株分离毒株均为FCV。对4个病毒分离株VP1基因进行RT-PCR扩增并测序,核苷酸序列比较显示4个病毒分离株均与一些经典FCV分离株同源性较高,与疫苗株差异性较高。将分离的病毒株感染幼猫,接种病毒3～4 d后,逐渐有猫出现死亡,第5 d死亡达到高峰（死亡7只）。接种后第2周,存活猫的精神状况略有好转,症状减轻,第2 d开始采集的鼻咽拭子RT-PCR检测FCV阳性,第6 d之后采集的鼻咽拭子中检测不到FCV,CH-SX4攻毒组在感染后第14 d采集的鼻咽拭子还能检测到病毒,所有试验组猫,于感染后第8 d均能检测到抗FCV抗体。而对照组的猫未见有异常表现。该研究成功的从山西地区采集的疑似FCV感染的鼻咽拭子中,分离获得4个FCV毒株,并对其进行了一系列的鉴定试验,攻毒感染试验表明,分离的4个毒株对幼猫有一定的致病性。感染后第8 d可以从所有存活猫体内检测到抗FCV特异性抗体,说明分离毒株具有较强的免疫原性,该研究对于FCV毒种的筛选及新型疫苗的研发提供了参考依据,可为该病的防制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• 前言
•   1 病原学
•   2 临床症状
•   3 发病机制
•     3.1 口腔和上呼吸道疾病
•     3.2 跛行
•     3.3 高致病性全身性疾病
•     3.4 分子发病机制
•   4 FCV病毒携带者的研究
•   5 流行病学
•   6 防治措施
•     6.1 疫苗
•     6.2 治疗
•     6.3 FCV相关呼吸系统疾病的治疗
•     6.4 FCV-VSD暴发的控制
•   7 研究目的和意义
• 试验内容
•   1 实验材料
•     1.1 毒株、细胞及病料来源
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要设备及耗材
•   2 方法
•     2.1 主要试剂配制
•       2.1.1 细胞培养基及配制
•       2.1.2 间接免疫荧光有关试剂配制
•       2.1.3 核酸电泳有关试剂配制
•     2.2 样品的处理及细胞培养
•       2.2.1 样品处理
•       2.2.2 F81 细胞复苏
•       2.2.3 F81 细胞传代
•       2.2.4 病毒分离
•     2.3 FCV病毒基因的扩增及鉴定
•       2.3.1 病毒RNA的提取
•       2.3.2 病毒c DNA的合成
•       2.3.3 病毒RT-PCR鉴定
•     2.4 噬斑纯化试验
•     2.5 电镜观察
•     2.6 病毒TCID50 测定
•     2.7 间接免疫荧光（IFA）
•     2.8 病毒VP1 基因的扩增
•     2.9 序列分析与遗传进化分析
•     2.10 幼猫致病性试验
•   3 试验结果
•     3.1 FCV毒株的分离
•     3.2 病毒RT-PCR鉴定
•     3.3 噬斑纯化试验
•     3.4 电镜观察
•     3.5 病毒TCID50 测定
•     3.6 间接免疫荧光试验
•     3.7 病毒VP1 基因PCR扩增结果
•     3.8 FCV序列分析及遗传进化树建立
•       3.8.1 FCV核苷酸序列分析结果
•       3.8.2 VP1 基因系统进化树分析
•     3.9 幼猫致病性试验结果
•       3.9.1 临床检测
•       3.9.2 HE染色病理切片观察结果
• 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• Abstract
• 英文缩略词表
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张然

导师: 闫芳

关键词: 猫杯状病毒,分离鉴定,噬斑纯化,间接免疫荧光

来源: 山西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山西农业大学

基金: 项目“宠物疾病诊疗与防控新技术研究”(项目编号:2016YFD0501000)

分类号: S852.65

DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000178

总页数: 53

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