一、我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析（论文文献综述）
黄芳[1]（2019）在《用于评价中和抗体广谱性的HIV-1假病毒系统的构建》文中提出截至2017年,HIV共计感染约7730万人,造成3540万人死于AIDS相关疾病,全球现有存活约有3690万人感染HIV。HIV潜伏感染、高突变性、破坏免疫系统等特征,是研发有效预防和治疗性疫苗的极大障碍。HIV疫苗研发、抗病毒治疗药物开发以及中和抗体评价鉴定,需要有效、标准的评估体系,基于HIV假病毒的细胞评价方法,是HIV研究的重要工具。本研究旨在构建能用于评价候选疫苗抗血清、中和抗体效价和广谱性的HIV Env假病毒体系,建立假病毒两质粒系统;实现HIV-1 Env假病毒10株全球盘代表性毒株和8株全球流行株的包装生产,涉及6种流行亚型（A、B、C、D、DC和G）和2种重组亚型（CRF07BC、CRFO1AE）。通过对比三种表达载体对重组Env表达以及假病毒包装效率差异,确定具有毒株Env表达通用性的真核表达载体pVRC8400;摸索优化转染条件,测定关键蛋白含量、病毒滴度,确定各毒株包装的最优条件。通过对比HIV-1流行株94UG114、NL4-3两质粒体系包装的假病毒与感染性分子克隆包装的真病毒在评价免疫血清、三类中和抗体的效价的差异,证明本研究所构建的假病毒可以替代真病毒工作。以该假病毒盘为工具,对实验室获得的广谱中和抗体、靶向CD4受体的抗体15A7、gp140交叉中和抗体进行中和效价和广谱性评价,为后续HIV疫苗的研究和中和抗体的开发提供了重要的评估工具。假病毒具有安全性高、应用性强和易于获得等优点,替代真病毒进行各类抗体、药物评价,对HIV-1研究具有重要意义。假病毒盘作为中和抗体性质鉴定的重要工具,对指导疫苗设计、攻克艾滋难题提供强有力支持。
杨舒婷[2]（2019）在《云南省HIV-1感染者中HCV、HHVs的感染和流行特征研究》文中研究表明云南省位于我国西南边陲,与东南亚国家相邻,HIV-1由周边国家多渠道传入,并呈现基因亚型/重组亚型分布复杂、多种基因型共同流行、新型重组持续发生的流行特征。因此,云南省一直被认为是中国HIV流行最为严重的地区,也是HIV感染和传播的中心。随着经济全球化的发展,跨境流动人群极大地促进了地区间经济发展,也增大了病毒传播和不同基因亚型病毒交流的机会。加之,HIV传播方式由静脉注射毒品逐渐转变为以性传播方式为主,使得HIV的感染和流行对女性的影响尤为严重。随着高效抗病毒疗法的推广使用,延长了艾滋病人的寿命,降低了艾滋病的发病率和死亡率,而机会性感染成为HIV病毒感染者发病和死亡主要原因。HCV和HHV的感染是AIDS患者中最常见的两种机会性感染。本研究对云南省HIV感染的人群中进行HCV、HHVs感染情况进行调查并阐明该人群中两种病原体流行株的感染和基因特征。对云南省731例HIV感染者中检测到85例HCV感染,感染率约为11.6%。该人群中有8种基因亚型共同流行,依次为3b（28.4%）、6n（24.7%）、3a（16.1%）、1a（12.3%）、1b（6.2%）、6u（6.2%）、6v（4.9%）和6a（1.2%）。与HCV单纯感染的毒株相比较,发现HIV/HCV合并感染者与HCV单纯感染者中HCV基因亚型的分布相似,但HIV/HCV合并感染者中6型所占比例增加,包括6a、6n、6u和6v多种亚型,未见2型病毒流行。所有HCV样本进行同源关系分析,结果显示,大多数HCV样本株与云南本地流行株以及有东南亚国家的流行株有较近的亲缘关系。而且,不同HIV-1亚型与HCV亚型之间存在一定关联性,CRF01AE感染样本中主要流行HCV三种基因型（1、3和6型）;CRF07BC感染者中主要流行1型和3型,并未感染6型HCV。其次,对121例云南省HIV-1感染人群中发现HHVs感染人数为108例,共感染率约89.3%,其阳性率高于对照组（62.2%）。HIV/HHVs合并感染者中最常见的病毒是HSV-2（65.3%）和HSV-1（59.5%）,而HHV-8（28.9%）和HHV-6（20.0%）在对照组中是最常见。统计分析表明,HSV-1（p<0.001）,HSV-2（p<0.001）和EBV（p<0.01）在两组之间存在显着差异。与对照组相比,HIV感染可能与多种HHV合并感染相关,尤其是超过2种不同HHV的共感染（P<0.001）。此外,HHVs与HIV感染之间存在显着正相关,可能与几个因素有关:年龄、婚姻状况、CD4细胞计数和当前高效逆转录抗病毒治疗方案。此外,我们对181例HIV女性感染者,包括HIV-1已知感染途径91例,未知感染途径90例,进行了HIV-1基因型分析。结果发现,该人群中主要流行的基因亚型为CRF01AE和CRF08BC,其次为B、C、CRF07BC及其他B/C重组。对主要流行亚型进行同源关系和起源进化特性分析发现,该人群中流行毒株在进化树中与已报道的性传播毒株显示较近亲缘关系,并在亚型树中普遍分布。研究结果提示近年来女性感染者在HIV的传播的流行其重要作用,应被重点关注。综上所述,本论文阐明了云南HIV感染人群中HCV与HHVs的分子流行特征,同时阐明了HIV-1在女性跨境人群中的流行特征。研究发现HIV感染者中的HCV和HHVs的感染与单纯感染都存在明显区别:HCV更倾向于6基因型（包括6a、6n、6u和6v）的感染;HHVs更可能同时存在多种病毒的感染和流行。同时,还揭示了在HIV防控工作中需要更加重视女性感染。本研究的结果将为云南地区HIV的治疗以及预防策略的制定提供直接的数据支持。
沈鸿霖[3]（2019）在《人类免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp140三聚体免疫原改造优化及其抗体筛选》文中研究表明艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合征。据世界卫生组织WHO数据结果显示,从HIV传染病被发现到现在,其感染者已经超过了7千万人,截止2017年底,全球仍有3690万人携带艾滋病病毒,死亡人数超94万人.截止2017年6月,我国仍有HIV感染者718270人,其中死亡221628人。虽然目前高效的抗逆转录病毒治疗（Highly Active AntiretroViral Therapy,HAART）在HIV病毒控制方面表现突出,可以抑制病毒复制,使得病人的生命得以延长并正常生活,但抗逆转录病毒治疗（ART）的需要是终生的,在经济上可能难以维持。因此,HHIV疫苗的研发对攻克艾滋病至关重要。HIV-1病毒粒子表面的包膜糖蛋白（Envelope glycoprotein,Env）Env三聚体能够和受体结合介导病毒与宿主细胞进行膜融合,是抗体识别的唯一靶标,因而成为HIV疫苗研发的重要靶点。SOSIP,NFL2P等类天然Env三聚体改造方案的报道使得类天然Env三聚体在体外高效表达成为了可能,并且该三聚体抗原能在动物实验中激起较高的血清中和滴度。这些研究均为HIV疫苗研发提供了指导意义和新希望。本研究以Expi293F悬浮细胞为表达载体,通过SOSIP和NFL2P等设计方案得到BG505、JR-FL以及NL4-3三个型别的三聚体蛋白表达质粒,扩大了抗原库,为抗体筛选和抗原设计奠定了基础。通过引入并适当延长His-tag标签简化了蛋白纯化的条件并提高了蛋白的纯化效率和纯度,目前蛋白的产量保持在10mg/L左右。间接性ELISA反应验证了表达的三聚体蛋白与广谱中和抗体有较好的亲和能力,且在电镜下能看到其三聚体形态。以三聚体蛋白作为免疫原进行动物免疫,能在动物体内激起较高的血清中和滴度,说明该三聚体抗原具有良好的生物学活性和免疫原性,并保留了天然Env三聚体上面的中和表位。采用多型别gp140三聚体蛋白进行低剂量序贯免疫和混合免疫,筛选到三株具有交叉中和能力的抗体,表明多型别的Env三聚体蛋白低剂量免疫反复刺激动物免疫系统的免疫方式更有利于诱导产生广谱中和抗体,为HIV疫苗设计中抗原改造和抗体筛选方面奠定基础并提供一定的指导意义。
韩婧婉[4]（2016）在《我国HIV-1流行毒株的分离鉴定及Rev蛋白第101位提前终止的生物效应研究》文中指出引发艾滋病的人类免疫缺陷病毒（HIV）具有高度的变异性。全球广泛传播的HIV-1分为M群、O群、N群和P群,HIV-1的M群包括9个亚型、72个流行重组毒株（CRFs）和无数独特重组毒株（URFs）。HIV-1不仅基因型高度多样,还有复杂的表型特征。主要包括复制能力和生长动力学、致细胞病变的作用、细胞嗜性、辅助受体使用和Env蛋白的V3环顶端氨基酸序列等。这些生物学表型特征之间有紧密的联系,并与HIV-1的致病性、传播能力、免疫逃逸及疾病进程密切相关。由于可代表体内病毒真实情况的HIV-1临床分离毒株难以获得,相对于基因序列水平的研究,表型研究的难度很大。正因如此,基因型研究获得的大量提示性结果也未能在表型层面得到验证。我国流行的HIV毒株复杂多样,主要流行毒株有B（包括Thai-B）、CRF01AE、CRF07BC和CRF08BC这4个基因型的毒株,还有大量新型重组毒株。目前,由于对我国HIV-1流行毒株生物学表型的研究缺乏,导致我们不能全面理解我国HIV-1流行毒株的生物学特征、不能科学解释近几年临床上发现的病程速率改变的现象,也极大地影响了疫苗等生物防治方法的研究。CRF07BC是在我国云南形成的以C亚型毒株为骨架插入B亚型片段的流行重组毒株,最初主要在吸毒人群中流行,近几年也扩散进入性传播人群特别是男男同性传播人群,占全国感染总数的35.5%。大量研究发现这个毒株具有独特的致病特征,例如,感染这个毒株的人初始CD4细胞计数相对较高病程进展可能较慢。然而此毒株的感染性和致病性相关因素目前尚缺乏研究。本研究首先进行了我国HIV-1流行毒株分离培养和全面的生物学表型特征研究,构建了具有充分多样性的毒株样本盘,并对我国常用的病毒载量和p24抗原检测试剂进行了评价。基于我们发现的以CRF07BC为代表的HIV-1C类病毒特有的Rev101提前终止现象,进行了Rev-RRE对复制和感染影响的研究。以期全面了解我国HIV-1流行毒株的表型特征,为揭示致病机制及生物防治研究奠定基础。第一章我国HIV-1流行毒株的分离鉴定和表型特征研究我国流行HIV-1毒株的基因型和表型的多样性对病毒传播和病程进展有显着影响。目前我国HIV-1多样性研究大多停留在序列和基因型层面,缺乏生物学表型研究,病毒表型多样性与毒力及致病性之间的关系亟待阐明。另外,hiv-1毒株的多样性和复杂性为艾滋病监测和诊断方法的完善,疫苗的研发和临床治疗带来了一系列挑战。目前缺少能代表我国hiv-1多样性的毒株样本盘用于对相关检测和生物防治方法的适用性评价。目的:分离培养我国流行的hiv-1毒株,对其复制能力和表型特征进行全面鉴定;建立一组能代表我国流行hiv-1毒株多样性并可以用于艾滋病检测方法评估的hiv-1样本盘。方法和结果:（1）样本的采集与病毒的分离培养:1)通过我国hiv-1耐药监测项目从10个省市收集48例hiv感染者的新鲜抗凝外周静脉血液样本,分离外周血单核细胞（pbmcs）,与健康供血者的pbmcs共培养,在生物安全3级实验室连续培养28天,期间定时补充细胞并扩大培养,获得我国2010年至2013年间hiv-1临床分离株14株。2)对我实验室2002年至2009年间初步分离的51株病毒进行扩大培养,获得稳定传代的病毒分离株16株。最终共获得30株高浓度（106-109cp/ml）、大量（>40ml）液氮冻存保种的病毒株。分离的病毒包括b（13例）,crf01ae（12例）和crf07bc（4例）三种我国广泛流行的毒株和较为罕见的g亚型（1例）毒株;传播途径包括血液传播（13例）、同性性传播（8例）、异性性传播（6例）、静脉吸毒传播（1例）及传播途径不明（2例）。（2）序列测定及基因型鉴定:对病毒基因组进行扩增和测序,得到6条hiv-1全长基因组序列、77条gag/pol区全长或envc2v3区序列（分别为25,27和25条）,经系统进化分析,证实30例样本包括如上所述4个亚型,且crf01ae毒株分属于3个传播簇。（3）复制动力学研究:p24抗原浓度大于2ng/ml的11株毒株中3株为相对快/高型（r/h）复制毒株,且均有致合胞体形成的能力（si）,其中一株crf01ae亚型的毒株复制能力极强,是参考毒株nl4-3的217倍。（4）通过envv3区序列预测env相关的表型:1)辅助受体使用:17株为使用ccr5辅助受体的m嗜性毒株,12株为使用cxcr4/ccr5的双嗜性毒株,有1例无法预测。快/高型复制且可致合胞体形成（syncytiainducing,si）的4个毒株都是x4/r5双嗜性,复制快/高但不致合胞体形成（non-syncytiainducing,nsi）的sx2010001只使用ccr5辅助受体;2)v3环顶端四肽包括gpgr,gpgq,gqgr,gpgh和gwgr共5种,复制相对较高的5个毒株的顶端四肽均为gpgr;3)糖基化位点:所有毒株的v3环糖基化位点为813个,其中17、30、36、42、98、131和137位为大部分毒株共有的糖基化位点,复制能力相对较高的5个毒株中有4个在第3位出现了n-糖基化,而其他毒株中均未出现此糖基化位点,提示可能与病毒的感染和复制能力相关。（5）根据pol区序列鉴定耐药突变位点:在得到pol区序列的27个毒株中有16个出现耐药突变位点,其中7个可能会出现中高度耐药,而其中2个未经治疗。（6）以30株hiv-1流行毒株作为样本盘对2种常用检测试剂进行评估:以30株病毒的培养上清液对nuclisenseasyqhiv-1version2.0和cobasampliprep/cobastaqmanhiv-1testversion2.0这2种病毒载量试剂盒进行评价,发现2种试剂盒对b亚型毒株的检测具有良好的一致性,而对crf01ae毒株检测的一致性相对较差,提示现有的试剂检测crf01ae毒株的病毒载量还有待改进。另外还评价了2种hiv-1p24抗原检测试剂。结论:获得了高浓度并大量冻存保种且人口学和生物学背景清晰的30株我国hiv-1流行毒株,具有充分的基因型和表型多样性。发现一株复制能力极强的crf01ae亚型毒株,发现常用的病毒载量试剂检测我国广泛流行的crf01ae毒株的一致性较差,提示需要针对crf01ae毒株改善性能。这项研究为揭示我国hiv-1的致病机制及生物防治研究奠定了基础。第二章hiv-1c类病毒rev蛋白第101位密码子提前终止现象及其生物效应研hiv-1的rev是病毒复制过程中的调节蛋白,通常由116个氨基酸组成,主要作用是特异性结合未剪辑及未剪辑完成的mrna上的rev蛋白反应元件（revresponseelement,rre）,帮助病毒mrna完成出核转运并进行后续表达。rre是病毒mrna经过多样化剪辑后,未剪辑或未剪辑完成的mrna的内含子上的一段rna,是rev蛋白结合mrna的靶标。通过rev与rre的相互作用,使得mrna得以转运出核膜完成表达。以往的研究主要针对欧美常见b亚型毒株rev蛋白的第3550位和第7384位氨基酸的两个主要功能域,未见对非b亚型rev蛋白及其c末端结构和功能的研究。在对我国部分地区hiv-1rev基因进行序列比对时,我们发现在绝大多数c亚型和以c为骨架的重组病毒,rev蛋白的第108位氨基酸（hxb2:101位）出现了一个提前终止密码子（prematureterminationcodon,ptc）,这在其它亚型毒株中极少见到。目的:鉴定rev蛋白101位提前终止现象（rev101ptc）是否为hiv-1c类病毒所特有。分析其对rev-rre功能活性、病毒复制能力以及病毒进化和传播的可能影响。方法与结果:（1）比较rev101ptc在hiv各类毒株中出现的频率以确定其是否为c类病毒的特征:从losalamoshivdatabase下载了hiv-1各亚型共3041条可用的rev基因序列,逐条比对校正并翻译,发现rev101ptc在hiv-1c类病毒（c亚型和以c为骨架的重组病毒）中出现频率为93.8%,而在其它亚型中出现的频率为0.9%（p<0.001）,证明rev101提前终止现象为c类病毒所特有。（2）验证rev101ptc对病毒复制能力的影响:1)将b亚型感染性克隆pnl4-3上rev第101位密码子caa（非终止）突变为taa（终止）,转染hek293t细胞并包装出病毒,发现rev101ptc的引入导致b亚型nl4-3毒株的复制能力的大幅下降（约24个log值）。2)以crf07bc为c类病毒的代表,将其感染性克隆pxjdc6291-13上rev第101位密码子taa（终止）突变为caa（非终止）,将突变前后质粒转染hek293t细胞,发现突变前后病毒的p24抗原（gag-pol编码）表达水平无差异。3)对编码rev蛋白的mrna进行二级结构预测,分析rev101ptc对B和crf07bc两个毒株revmrna二级结构的影响。发现rev101ptc的引入造成b亚型revmrna的“茎环”易位,显着改变其二级结构;而rev101ptc存在与否对crf07bcrevmrna的二级结构并无影响,只是“茎状”结构上一个gu配对变为gc配对。4)为了验证rev101ptc的引入是否会影响rev蛋白的表达水平,将2种亚型rev101密码子突变前后的表达质粒等量转染hela细胞,通过westernblot检测rev蛋白表达水平。发现revb>revbmut（101ptc）,而rev07bc（101ptc）≈rev07bcmut,说明rev101ptc对b亚型rev蛋白的表达有影响,而对crf07bc的rev蛋白的影响不明显。（3）构建gagpol-rre报告基因表达体系并验证rev101ptc和不同基因型的rre对rev-rre复合体功能的影响:构建b和crf07bc毒株有和没有101ptc的4个rev表达质粒（pcdna3.1（+）-rev-b、pcdna3.1（+）-rev-bmut（101ptc）、pcdna3.1（+）-rev-07bc（101ptc）和pcdna3.1（+）-07bcmut）;构建b和crf07bc毒株的rre连接gag-pol基因的2个报告基因质粒（pcdna3.1（+）-gagpol-rreb和pcdna3.1（+）-gagpol-rre07bc）。将2个报告基因质粒分别与4个rev表达质粒配对,组成8个反应体系。用不同浓度梯度的rev表达质粒与报告基因质粒共转染,外源rev蛋白就结合报告基因质粒上的rre,帮助与之相连的gag-pol基因完成出核表达,检测培养上清液中gag-pol的表达产物（p24抗原）,绘制p24含量随rev表达质粒浓度变化的曲线,以曲线上升段线性拟合的斜率为指标衡量rev-rre的相对活性。对得到的8组数据分别从rev和rre的角度进行比较分析:1)rev101ptc对rev-rre活性的影响:只有在rev和rre均为b亚型时,rev101ptc才使rev-rre的功能活性显着下降（p=0.0017）,其他组合rev-rre的功能活性均无显着变化;而不论是否有rev101ptc,使用b亚型rre组合的rev-rre功能活性均显着高于使用crf07bc亚型rre的组合,提示rre的亚型特征对于rev-rre功能活性的影响比rev更大。2)rre亚型特征对于rev-rre活性的影响:只在与crf07bc的野生型rev（含rev101ptc）结合时,2种rre对rev-rre活性的影响才无显着性差异（p=0.074）。而与不含rev101ptc的rev07bcmut结合时,2种亚型RRE所造成的差异变得具有显着性（P=0.017）。与突变前后的RevB结合时,2种亚型RRE所造成的差异更大（P值分别为0.001和0.006）。（4）探究RRE上亚型特异性位点对Rev-RRE活性的影响:在2种亚型的RRE上选择处于Rev结合位点或影响其二级结构的4组关键位点及突变,分别引入2种亚型的GagPolRRE报告基因,构建8个质粒,将突变前后的RRE分别与相应的Rev结合,检测其对Rev-RRE功能活性的影响。结果显示,对于RRE B,T192A和G262AG264A突变导致Rev B-RRE B的功能活性显着降低（T192A:P=0.0005;G262AG264A:P<0.0001）。对于RRE 07BC,A111G-G120A和A262G-A264G导致Rev07-RRE07活性降低显着影响（P值分别为0.0171和0.0019）,而A192T则使其活性升高（P=0.0024）。提示192位碱基的改变对RRE功能的影响与两个亚型RRE本来的活性趋势一致;262-264位点的碱基在两个亚型间的正反向突变均会造成Rev-RRE活性的显着下降。结论:发现并证实Rev101提前终止密码是HIV-1 C类病毒特有的现象。它在B亚型Rev编码基因中的引入会显着降低B亚型病毒的复制能力,这可能是通过打乱原有mRNA二级结构影响Rev蛋白自身表达量来减少其它病毒蛋白的表达而造成的。但它的存在与否对HIV-1C类病毒的复制并无影响,这可能与其mRNA二级结构并不会因Rev101PTC而受到影响有关。C类病毒Rev蛋白可以兼容B亚型和C亚型的RRE,这可能是C类病毒Rev蛋白编码基因在所有已发现的B/C重组毒株中得以保留的原因,与C类病毒维持适应和传播优势有关。Rev101提前终止密码可能有助于C亚型Rev维持其自身的稳定性或兼容性。两个亚型毒株RRE上第192位使用碱基的差异可能是造成两个亚型Rev-RRE的功能活性差异的原因之一;而两个亚型RRE上第262位和264位核苷酸对于维持Rev-RRE功能活性至关重要。
姚亚萍[5]（2013）在《浙江省2004-2011年HIV-1流行毒株的传播和进化研究》文中研究指明为了解浙江省HIV-1毒株的亚型分布、传播特征和流行趋势,我们在2004-2011年间募集部分HIV-1抗体阳性病例,采集静脉抗凝全血,提取前病毒DNA或病毒RNA,通过基因扩增、序列测定,获得HIV-1gag和pol基因片段。运用Mega等软件构建Neighbor-Joining系统进化树,分析基因亚型和遗传多样性;运用Simplot和RIP等软件分析新发重组毒株的重组断点；运用Bayesian系统进化分析并结合流行病学资料,探讨浙江省CRF01AE毒株的起源、传播和流行趋势。研究表明,流行早期,HIV-1通过异性性接触途径传播进入浙江,进而播散流行,从高危人群向一般人群扩散；近几年,男男性行为人群中的HIV-1播散快速,成为浙江省最主要受累群体。浙江省内流行毒株亚型多样,来源复杂,主要毒株类型为CRF01AE、CRF07BC、CRF08BC和B’（B）,约占93%。但也存在C, G. CRF02AG, CRF06CPX等其他类型以及01B新发重组毒株（3个病例）和CRF07BC/08BC再重组毒株（5个病例）,表明浙江HIV流行毒株类型复杂,疫情活跃,感染不同毒株的高危人群间存在交叉现象。这些特征符合浙江省艾滋病疫情多种途径、多种来源、以性接触传播为主的传播流行方式。从基因距离和Neighbor-Joining系统进化树判断,B亚型最早进入浙江,然后是B’、CRF01AE、 CRF08BC、CRF07BC。Bayesian系统进化分析显示,CRF01AE毒株1998年前后传播进入浙江,通过异性性接触和男男性行为进行广泛播散,并逐步成为浙江省的优势毒株。系统进化分析提示浙江与广西、江西和安徽等省病例具有直接或间接流行病学关联性。动态分析表明浙江省HIV疫情活跃,流行毒株复杂。浙江应加强与江西、安徽等周边省份联系,制定针对重点人群的预防和干预措施,提高防控效率,控制疫情蔓延。
李琳[6]（2010）在《HIV-1潜伏的人Jurkat T细胞模型的建立及中国流行株HIV-1 B/C重组亚型感染人脐带血造血祖细胞的研究》文中研究说明高效抗逆转录病毒疗法有效地抑制了HIV的病毒复制,减缓了疾病进程,但并不能彻底清除HIV。这其中重要的原因在于由HIV潜伏感染细胞构成的病毒储存库的存在。而建立HIV潜伏感染相关的各种体外细胞模型,则有助于阐明HIV潜伏储存库的形成机制以及用于清除储藏库的药物筛选。此外,国外对HIV-1能否感染造血祖细胞尚未定论,中国流行株HIV-1 B/C重组亚型能否感染人造血祖细胞也未见报道,对该问题的探讨也将为建立HIV-1在造血祖细胞上的潜伏模型奠定基础。鉴于此,本课题利用分子生物学、细胞生物学及病毒学等方法手段,对上述问题进行了如下研究：在第一部分的研究中,首先,我们制备了一种表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）的HIV-1假病毒。采用离心感染的方式以106TCID50的病毒剂量感染人Jurkat T细胞后,采用流式细胞术分选出GFP-细胞群。然后,经激活剂（200 nM TSA和10ng/ml PMA）刺激,用流式细胞术再次分选出GFP+细胞,并通过有限稀释法制备并筛选获得5个单克隆细胞系。最后,对这5个单克隆细胞系在激活剂刺激前后HIVp24抗原的表达进行了检测,并进一步用巢式Alu-LTR PCR的方法证实了这些单克隆细胞系基因组中整合有HIV-1的基因组。这些结果显示出我们已成功地建立了HIV-1潜伏感染细胞模型。该模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制打下了工作基础,也为建立HIV-1其他类型细胞潜伏感染模型奠定了基础。在第二部分的研究中,首先,我们从健康产妇的脐带血中用免疫磁珠法分离获得纯度为95-99%且具备多向分化能力的造血祖细胞（Hematopoietic Progenitor Cells,HPCs）。然后,制备HIV-1 B/C重组亚型的假病毒,采用不同剂量（50 TCID50、200 TCID50、1000 TCID50）的假病毒感染CD34+ HPCs,在多个时相点上用Elisa方法检测细胞上清中p24的表达水平,结果显示出p24的表达水平与其感染病毒剂量高低有关；Alu-LTR PCR检测结果显示出HIV-1病毒基因能够整合在宿主基因组上。这些研究结果提示了中国流行株HIV-1 B/C重组亚型能够感染人脐带血造血祖细胞。最后,我们进一步用流式直标抗体染色及Real-time PCR方法对CD34+ HPCs上受体的表达进行了检测,其结果显示CD34+ HPCs亚群不同程度上有HIV-1感染所需的CD4、CR5和CXCR4等受体的表达,提示了HPCs这些表面受体的存在可能是被HIV-1感染的原因。
李悦[7]（2009）在《携带中国CRF07BC HIV-1毒株env基因的嵌合病毒SHIV构建及体内外生物学活性检测》文中进行了进一步梳理艾滋病已成为影响人类健康最严重的传染性疾病之一,各国迫切需要研制安全有效的艾滋病疫苗,然而至今还未有成功的范例。疫苗的安全性、有效性以及免疫策略需要在合适的动物模型中进行评价,SHIV/恒河猴模型是应用最为广泛的动物模型之一。SHIV,即SIV/HIV嵌合病毒,是利用基因重组技术,将SIV和HIV的相应基因进行置换而构建出来的重组嵌合病毒,然而尚未有代表中国HIV流行株高致病SHIV和动物模型。构建中国HIV-1 CRF07 BC主要流行株基因CCR5嗜性的致病性SHIV/恒河猴艾滋病模型,对于设计艾滋病疫苗和免疫保护效果评价可以发挥重要作用。本研究以SHIV-89.6P的克隆株SHIV-KB9为主要骨架,将从AIDS患者临床样本中制备gp120和部分gp41（从N末端的50到780个氨基酸）的KpnI-BamHI基因片段替换SHIV-KB9的相应区域,得到76个携带中国主要流行亚型CRF07 BC不同毒株env基因的SHIV cDNA嵌合克隆。将这些重组病毒cDNA转染293T细胞,收集病毒上清,分别感染TZM细胞系、人和猴的PBMC细胞,对所有克隆的生物学活性进行细胞水平鉴定。通过SIV p27衣壳蛋白滴定,筛选到4株具有感染活性的SHIV cDNA克隆,分别为SHIV-XJN0363A4,SHIV-XJN036388,SHIV-XJN0421A17和SHIV-XJDC6431。通过对这4株SHIV病毒在恒河猴淋巴细胞中感染能力的比较,筛选活性最高的SHIV-XJDC6431进行一系列细胞水平生物活性的比较。透射电镜观察到SHIV-XJDC6431 cDNA克隆在293T转染细胞系中包装出病毒颗粒;利用表达不同辅助受体的细胞系确定SHIV-XJDC6431具有CCR5嗜性;SIVp27衣壳蛋白滴定描绘出其在人、恒河猴PBMC中的复制动力学曲线,复制能力低于SHW-KB9,但高于本室构建的SHIV-XJ01270和SHIV-CN97001;被感染过的恒河猴PBMC出现明显的细胞病变;DNA PCR检测到病毒已成功整合到人、恒河猴PBMC的基因组中;RT-PCR检测到病毒在人、恒河猴PBMC培养上清中gag-pol RNA转录本和（或）RNA基因组的形成。随后,将1000TCID50的SHIV-XJDC6431病毒静脉注射两只中国恒河猴443号和444号,两只恒河猴感染特征基本一致。感染后20天左右出现病毒载量,峰值出现时间较晚,仅达到105.12pg/ml和105.47pg/ml。检测结果表明SHIV-XJDC6431可在第一代恒河猴443、444中有效复制,两只动物均表现出潜伏期稳定的低水平病毒血症过程。在444感染后第65天进行了一次猴体传代实验,发现经过体内适应的病毒在第二代恒河猴体内（445号）表现出较高的感染活性和复制能力,感染445后第15天可检测到病毒载量,且峰值出现在19天,可达到106.98pg/ml。通过病毒载量和外周血CD4+T淋巴细胞计数分析,发现第一代动物表现出的感染活性较弱,与SHIV-KB9相比病毒载量峰值较低并且检测到载量的时间点滞后。总之,本研究成功构建了四株在细胞水平具有感染活性的携带中国流行亚型HIV-1 env基因片断的SHIV病毒株,其中一株SHIV-XJDC6431在动物体内已验证具有生物学活性。同时,经过猴体传代试验能够提高其感染、复制能力,并期望经过后期多次动物体内传代实验,能够筛选到高致病性的携带中国流行亚型env基因的SHIV病毒,为构建评价AIDS/HIV疫苗的动物模型提供物质基础。
孟哲峰[8]（2008）在《基于全长基因组的HIV-1 CRF07BC毒株流行特征及病毒基因功能研究》文中提出CRF07BC重组毒株是我国HIV主要流行毒株之一,该毒株传播和流行迅速,急需了解其流行株基因组特点和病毒生物学特征。本研究选择其主要流行地区——四川和新疆,进行代表株的基因组特征及地区间毒株传播关系的研究,同时,构建CRF07BC感染性克隆并用于病毒生物学研究。与早期分离毒株比较,新获得的10条CRF07BC毒株基因组发生了显着的变异,变异程度最高的是env和nef基因;编码基因的氨基酸序列分析同时表明,存在一些CRF07BC毒株特异性的突变特征或保守氨基酸基序。毒株进化关系分析发现两组与起源相关的早期CRF07BC毒株:四川、乌鲁木齐早期毒株和云南、广西早期毒株,前者与四川——新疆传播路线关系密切。不论早期还是近期毒株,甘肃、四川和新疆流行毒株间有明显的传播关系。在CRF07BC重组毒株中发现亚型特异性突变——Gag P6蛋白7个氨基酸的缺失突变,缺失毒株起源于非缺失毒株,并可能有多个不同的毒株起源,该缺失型毒株在人群中有较高的流行率,可能为传播优势毒株。P6蛋白三维构象分析提示该突变将影响蛋白功能,进而可能影响毒株适应性和宿主疾病进程。LTR功能和全长克隆策略对感染性克隆构建至关重要,pNL4-3的LTR能成功用于拯救CRF07BC毒株前病毒基因组。三个pNL4-3-07BC的嵌合克隆表现出较弱的体外细胞感染能力,特殊的基因突变影响克隆病毒感染能力:Gp41突变增强克隆病毒的复制能力,Vpr突变则导致另一克隆病毒的复制能力更弱。本研究填补了当前国内CRF07BC毒株全长基因组和感染性克隆研究的空白,发现了一些重要的突变特征或保守基序,并阐明了早期毒株的传播和进化关系。另外,简单、高效的前病毒拯救策略将为病毒生物学研究提供有力的工具。较弱的感染能力限制了新构建感染性克隆的广泛应用,这也提示全长克隆构建策略还需要进一步的提高和优化。
苗文泉[9]（2008）在《我国部分地区HIV-1毒株的分离培养与基因序列特征研究》文中指出分离我国流行的HIV毒株并进行相关基因序列特征的分析是建立我国HIV毒种库,认识我国HIV的生物学特征、分析其流行和变异重组规律的重要基础;全基因组的序列测定有助于阐明毒株的进化特征,可以为有关病毒流行特征等方面的研究提供一个完整、清楚的遗传学和分子生物学背景。本研究首先对我国部分地区流行的HIV-1毒株进行分离培养,对其中的部分毒株进行了gag, pol, env基因特征进行分析,对2株病毒进行了全基因组序列测定和研究。目的分离我国部分地区流行的HIV-1毒株,了解分离毒株的生物学及基因序列特征。方法用外周血单核细胞（PBMCs）体外共培养的方法从我国HIV-1感染者中分离原代HIV-1毒株,分析毒株的体外生长动力学特征和融合诱导性。提取病毒基因组RNA,反转录PCR扩增病毒的gag,pol,env区基因并进行序列测定,使用软件Clustal,BioEdit version,MEGA3.1对基因序列特征进行分析。提取NX2、SH52两个HIV-1毒株的前病毒基因组DNA,套式PCR方法扩增全长基因组并分段测序,使用SimPlot软件进行基因序列重组分析。结果将本室冻存的67株初步分离呈阳性反应的毒株复苏传代,得到37株稳定传代的病毒;从5个省市的270名HIV-1感染者外周血中分离出58株HIV-1原代毒株。分离株的体外生长动力学呈现快/高、慢/高、慢/低三种类型。病毒载量越高分离的阳性率(HC=78.959,χ2（1）0.01=6.63.P<0.01)越高、同时病毒分离株呈快高型生长的比例增大。52株分离株的序列呈现B（欧美B、泰国B’）、CRF01AE重组、CRFBC重组和G 4种亚型;以B亚型分布最广,CRF01AE重组株主要分布在广西,上海发现G亚型病毒。V3环顶端四肽GPGR广泛的分布于B亚型和CRFAE亚型中。CRF01AE亚型毒株的V3环平均净电荷数略高于B亚型;基因离散率分析显示,env基因离散率远高于gag和pol基因;CRF01AE亚型病毒pol和env区基因离散率均在三种亚型中最高。表型预测显示多数为利用CCR5辅助受体、M嗜性的毒株。扩增得到NX2 08BC重组亚型和SH52 G亚型全长基因组序列。NX2 CRF08BC重组亚型在3个位置发生重组,分别位于gag,pol和nef区,重组位点位于1000nt,2600nt和9200nt。结论传代分离出我国部分地区的HIV-1流行毒株95株;毒株呈现多种体外复制动力学特征,并与血浆HIV-1病毒载量水平相关;毒株呈现多种亚型（B、CRF01AE重组、CRFBC和G）,在不同传播途径和地区具有不同的分布;env基因离散率远高于gag和pol基因, HIV-1毒株多数是不致细胞病变的M嗜性、NSI表型;V3环序列变化较大。得到2株HIV-1毒株的全长基因组序列,亚型分别为CRF08BC和G亚型。
李昌[10]（2008）在《新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究》文中研究说明本研究针对当前AIDS/HIV治疗中面临的病毒变异快、病毒感染细胞贮存池难以清除、病毒感染造成机体免疫功能损伤等关键问题,以构建具特异杀伤和免疫治疗双重功能的基因工程制剂为目标,筛选能够与HIV-1膜蛋白特异结合的抗病毒蛋白西诺维恩（CVN）、格瑞弗森（GRFT）以及免疫诱导因子金黄色葡萄球菌外毒素A（SEA）为研究对象,利用细菌和酵母表达系统,获得了重组抗病毒蛋白CVN、GRFT及其偶联SEA的重组导向制剂CS、GS,对其进行初步活性分析。同时制备了稳定表达中国流行株HIV-1膜蛋白的靶细胞模型,利用该模型,通过免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光测定（IFA）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤试验等,对CVN、GRFT及其重组导向制剂CS、GS的体外结合活性、细胞结合活性及细胞杀伤活性进行研究。结果表明,成功获得了抗病毒蛋白和重组导向制剂,并且都具有良好的细胞结合活性。重组导向制剂可非特异性活化PBMCs、特异性介导CTLs杀伤表达HIV-1膜蛋白的靶细胞,为该制剂进一步推向临床奠定了基础。
二、我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析（论文提纲范文）
（1）用于评价中和抗体广谱性的HIV-1假病毒系统的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| Abbreviations |
| 第一章 前言 |
| 1. AIDS流行情况 |
| 1.1 AIDS在全球流行情况 |
| 1.2 AIDS在中国流行情况 |
| 2. HIV生物学特征 |
| 2.1 HIV起源、危害与分类 |
| 2.2 HIV结构与基因组 |
| 2.3 HIV生活周期 |
| 3. HIV预防与治疗研究 |
| 3.1 HIV-1广谱中和抗体研究与疫苗设计 |
| 3.2 HIV疫苗设计面临的困难 |
| 3.3 抗病毒治疗 |
| 4. HIV假病毒 |
| 4.1 假病毒 |
| 4.2 HIV假病毒分类 |
| 4.3 HIV假病毒的应用 |
| 4.4 评价抗体中和能力的HIV-1 Env假病毒参考盘的建立 |
| 4.5 HIV假病毒的应用优势及局限性 |
| 5. 本研究的思路、方法和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要仪器与设备 |
| 1.2 菌株、质粒、蛋白、抗体、细胞、实验动物 |
| 1.3 常用实验溶液配制 |
| 2. 方法 |
| 2.1 分子克隆实验操作方法 |
| 2.2 细胞实验操作方法 |
| 2.3 蛋白鉴定方法 |
| 2.4 ELISA实验 |
| 2.5 免疫荧光 |
| 2.6 动物实验 |
| 2.7 单克隆抗体的制备方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1. HIV-1假病毒的构建与鉴定 |
| 1.1 HIV-1 Env包膜蛋白真核表达载体的选择 |
| 1.2 HIV-1 Env表达质粒的克隆构建 |
| 1.3 HIV-1 Env表达鉴定 |
| 1.4 包装HIV-1假病毒的转染条件优化 |
| 1.5 HIV-1相关蛋白含量与假病毒滴度测定 |
| 1.6 本节小结 |
| 2. HIV-1假病毒与真病毒的生物学性质比较 |
| 2.1 TZM-b1细胞感染实验 |
| 2.2 对免疫小鼠多抗血清中和能力评价的比较 |
| 2.3 对广谱中和抗体、鼠源单克隆抗体中和能力评价的比较 |
| 2.4 负染电镜结果比较 |
| 2.5 本节小结 |
| 3. HIV-1假病毒系统的应用 |
| 3.1 HIV-1假病毒评价bnAbs的中和反应性 |
| 3.2 HIV-1假病毒评价gp140单克隆抗体的中和反应性 |
| 3.3 HIV-1假病毒评价靶向CD4受体的单克隆抗体15A7的中和反应性 |
| 3.4 本节小结 |
| 讨论 |
| 1. HIV-1假病毒平台构建 |
| 2. HIV-1假病毒的滴度 |
| 3. HIV-1假病毒平台的应用 |
| 4. HIV-1假病毒构建的意义及难点 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（2）云南省HIV-1感染者中HCV、HHVs的感染和流行特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人类免疫缺陷病毒(HIV)与艾滋病(AIDS) |
| 1.1.1 HIV发现及命名 |
| 1.1.2 HIV病毒学特征 |
| 1.1.3 HIV基因型分型与变异 |
| 1.2 HIV的传播与流行 |
| 1.2.1 HIV传播途径 |
| 1.2.2 HIV-1在全球的流行及基因型分布 |
| 1.2.3 HIV-1在中国的流行及基因型分布 |
| 1.2.4 HIV-1在云南的流行及基因型分布 |
| 1.3 HIV机会性感染 |
| 1.3.1 机会性感染的病原体 |
| 1.3.2 HIV与HCV合并感染 |
| 1.3.3 HIV与HHVs合并感染 |
| 1.3.4 机会性感染的预防与治疗 |
| 1.4 HIV与高危人群 |
| 1.4.1 HIV与高危人群 |
| 1.4.2 HIV与女性感染者 |
| 1.4.3 HIV与流动人群 |
| 1.5 云南省特殊地理位置 |
| 1.6 本论文研究的目的意义 |
| 第二章 云南省HIV-1感染人群中HCV的分子流行病学特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要试剂与仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 病毒RNA的提取 |
| 2.3.2 HCV样本5'UTR扩增 |
| 2.3.3 HCV样本NS5B扩增 |
| 2.3.4 HIV-1样本gag-pol扩增 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.6 样本纯化及测序 |
| 2.3.7 序列拼接和同源关系分析 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HIV-1感染者中HCV感染率 |
| 2.4.2 合并感染人群的特征 |
| 2.4.3 HCV基因亚型分布 |
| 2.4.4 HIV和HCV基因型相关性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 云南省HIV-1感染人群中的HHVs的流行和相关风险因素分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要试剂与仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 病毒DNA核酸提取 |
| 3.3.2 HHVs样本巢式PCR扩增 |
| 3.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.3.4 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 人口学资料统计分析 |
| 3.4.2 HHVs感染情况 |
| 3.4.3 HIV/HHVs合并感染相关风险因子 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 云南省女性跨境人群中HIV-1的基因特点分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要试剂与仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 病毒RNA的提取 |
| 4.3.2 HIV-1样本巢式PCR扩增 |
| 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 4.3.4 样本纯化及测序 |
| 4.3.5 数据分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人口学资料 |
| 4.4.2 云南省HIV-1女性跨境人群基因型分布特征及同源关系分析 |
| 4.4.3 云南省HIV-1女性跨境人群主要流行基因亚型的起源与进化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（3）人类免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp140三聚体免疫原改造优化及其抗体筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HIV流行病学现状 |
| 1.2 HIV的生物学特征 |
| 1.2.1 HIV的分类学特征 |
| 1.2.2 HIV病毒基因组及其结构特征 |
| 1.2.3 病毒生活周期 |
| 1.3 HIV-1病毒中和表位及其相关广谱中和抗体 |
| 1.3.1 V1/V2区及其相关广谱中和抗体 |
| 1.3.2 V3区及其相关广谱中和抗体 |
| 1.3.3 CD4 binding site及其相关广谱中和抗体 |
| 1.3.4 gp120/gp41交界面融合肽FP及其相关广谱中和抗体 |
| 1.3.5 MPER及其相关广谱中和抗体 |
| 1.4 HIV-1疫苗的研究进展 |
| 1.5 类天然HIV-1包膜糖蛋白Env三聚体抗原改造策略 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 质粒、菌株、蛋白、细胞等 |
| 2.1.3 常用试剂与耗材 |
| 2.1.4 常用溶液及培养基配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 分子克隆常规操作 |
| 2.2.2 细胞实验常规操作 |
| 2.2.3 蛋白纯化与鉴定 |
| 2.2.4 免疫方案的设计 |
| 2.2.5 小鼠免疫与单抗筛选相关实验 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 多型别类天然Env三聚体免疫原设计方法及其转染条件的摸索 |
| 3.1.1 多型别类天然Env三聚体免疫原设计方法及其克隆构建 |
| 3.1.2 多型别类天然Env三聚体转染条件的摸索 |
| 3.2 类天然多型别Env三聚体蛋白的纯化与鉴定 |
| 3.2.1 抗原纯化 |
| 3.2.2 抗原相关鉴定 |
| 3.3 小鼠免疫及其中和单抗的筛选 |
| 3.3.1 动物免疫及其血清中和滴度检测 |
| 3.3.2 中和单抗的筛选制备 |
| 3.4抗体性质分析 |
| 3.4.1 抗体分型 |
| 3.4.2 抗体表位鉴定 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 多型别类天然Env gp140三聚体的改造 |
| 4.2 哺乳动物真核悬浮细胞表达蛋白 |
| 4.3 多型别类天然Env gp140三聚体的纯化 |
| 4.4 多型别类天然Env gp140三聚体的性质鉴定 |
| 4.5 小鼠免疫方案的设计 |
| 4.6 中和单抗的性质鉴定 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）我国HIV-1流行毒株的分离鉴定及Rev蛋白第101位提前终止的生物效应研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 我国HIV-1 流行毒株的分离鉴定和表型特征研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 病人血液标本 |
| 1.2.2 病毒分离培养上清液 |
| 1.2.3 人外周血单核细胞 |
| 1.2.4 细胞培养基 |
| 1.2.5 主要试剂 |
| 1.2.6 主要实验仪器 |
| 1.2.7 相关软件 |
| 1.2.8 引物 |
| 1.2.9 主要耗材 |
| 1.2.10 统计学方法 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 病毒的分离与培养 |
| 1.3.2 病毒基因的扩增和测序及基因型多样性分析 |
| 1.3.3 复制动力学曲线检测 |
| 1.3.4 表型预测 |
| 1.3.5 耐药突变的确定 |
| 1.3.6 病毒载量检测方法和p24抗原检测方法的评估 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 病毒的分离和扩大培养 |
| 1.4.2 病毒基因的扩增测序及基因型多样性分析 |
| 1.4.3 复制动力学曲线的测定 |
| 1.4.4 辅助受体/V3环顶端四肽/V3环糖基化位点预测结果 |
| 1.4.5 耐药突变的确定 |
| 1.4.6 p24抗原检测方法和病毒载量检测方法的评估 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 HIV-1 C类病毒Rev蛋白第101位提前终止密码子及其生物效应研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒 |
| 2.2.2 细胞 |
| 2.2.3 细胞培养基 |
| 2.2.4 抗体 |
| 2.2.5 引物 |
| 2.2.6 主要仪器 |
| 2.2.7 其它耗材 |
| 2.2.8 相关软件 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 不同基因型HIV-1 中Rev101PTC出现频率的统计及比较 |
| 2.3.2 Rev101PTC对B和CRF07_BC毒株复制能力的影响 |
| 2.3.3 Rev-RRE功能活性测定 |
| 2.3.4 RRE亚型特异性位点对于Rev-RRE活性的影响 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 Rev101PTC是HIV-1 C亚型和C类重组型的亚型特征 |
| 2.4.2 Rev101PTC降低B毒株复制但对CRF07_BC蛋白表达无影响 |
| 2.4.3 Rev101PTC和RRE亚型特征对Rev-RRE活性的影响 |
| 2.4.4 部分RRE亚型特异性位点对Rev-RRE活性的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）浙江省2004-2011年HIV-1流行毒株的传播和进化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 研究对象和样本处理 |
| 2.2 实验仪器、试剂和耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 序列结果分析 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 研究样本的分布与特征 |
| 3.2 浙江省HIV-1亚型分布情况 |
| 3.3 浙江省流行毒株的进化分析 |
| 3.4 同性恋和异性恋人群HIV-1流行特征分析 |
| 3.5 浙江省HIV-1毒株传播关系分析 |
| 3.6 新的重组毒株的发现和验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（6）HIV-1潜伏的人Jurkat T细胞模型的建立及中国流行株HIV-1 B/C重组亚型感染人脐带血造血祖细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 |
| 1、前言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、实验结果 |
| 3.1 HIV-1假病毒的制备和滴度检测 |
| 3.2 HIV-1假病毒感染Jurkat细胞的条件优化 |
| 3.3 HIV-1假病毒感染Jurkat细胞后的GFP细胞分选 |
| 3.4 GFP-细胞的激活实验(潜伏感染细胞的激活) |
| 3.5 潜伏感染单克隆细胞系的制备 |
| 3.6 潜伏感染单克隆细胞系的鉴定 |
| 3.7 潜伏感染单克隆细胞系的简单应用 |
| 4、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 1、前言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 人脐带血CD34~+HPCs的纯化、鉴定及培养 |
| 3.2 HIV-1假病毒的制备和滴度检测 |
| 3.3 HIV-1假病毒在CD34~+HPCs中的感染实验 |
| 3.4 HIV-1感染人脐带血CD34~+HPCs可能性的机制探讨 |
| 4、讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）携带中国CRF07BC HIV-1毒株env基因的嵌合病毒SHIV构建及体内外生物学活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 第一节 HIV的研究概况 |
| 1.1.1 AIDS的病原学 |
| 1.1.2 HIV的致病机理 |
| 1.1.3 HIV的免疫应答 |
| 第二节 AIDS疫苗研究概况 |
| 1.2.1 AIDS疫苗发展策略 |
| 1.2.2 中国AIDS疫苗研究 |
| 第三节 本研究的目的和意义 |
| 1.3.1 AIDS疫苗评价的动物模型 |
| 1.3.2 SHIV的研究进展 |
| 1.3.3 立题依据及研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 质粒 |
| 2.1.2 主要工具酶 |
| 2.1.3 主要生化试剂及溶液的配制 |
| 2.1.4 试剂盒 |
| 2.1.5 HIV标本来源及亚型分类 |
| 2.1.6 菌株 |
| 2.1.7 细胞 |
| 2.1.8 耗材 |
| 2.1.9 主要仪器和设备 |
| 2.1.10 抗体 |
| 2.1.11 主要生物软件和分析工具 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 文中使用的SHIV感染性分子克隆及本课题的构建方案设计 |
| 2.2.2 HIV感染者基因组DNA提取及目的基因扩增 |
| 2.2.2.1 HIV感染者基因组DNA的提取 |
| 2.2.2.2 目的基因的扩增 |
| 2.2.3 SHIV cDNA克隆的构建 |
| 2.2.3.1 PCR产物的纯化 |
| 2.2.3.2 PCR产物的克隆 |
| 2.2.3.3 质粒的小量提取 |
| 2.2.3.4 半长SHIV克隆的筛选和鉴定 |
| 2.2.3.5 全长SHIV克隆的构建和鉴定 |
| 2.2.3.6 全长SHIV克隆的特殊培养条件 |
| 2.2.3.7 全长SHIV质粒的大量制备 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 在细胞水平具有感染活性的SHIV cDNA克隆的筛选 |
| 2.2.5.1 SHIV质粒转染293T细胞系 |
| 2.2.5.2 SHIV病毒P27浓度测定 |
| 2.2.5.3 SHIV病毒在TZM细胞中的复制 |
| 2.2.5.4 SHIV病毒TCID_(50)滴定(TZM-bl细胞系) |
| 2.2.5.5 SHIV在恒河猴PBMC中的复制 |
| 2.2.5.6 SHIV在人PBMC中的复制 |
| 2.2.5.7 恒河猴CD4~+T细胞的分离 |
| 2.2.5.8 基因组DNA的提取及DNA-PCR |
| 2.2.5.9 病毒颗粒电镜照片观察 |
| 2.2.5.10 细胞嗜性测定 |
| 2.2.5.11 感染细胞病变观察 |
| 2.2.5.12 SHIV-XJDC6431亚型分类 |
| 2.2.6 猴体动物实验 |
| 2.2.6.1 恒河猴的准备 |
| 2.2.6.2 恒河猴的病毒接种 |
| 2.2.6.3 样品的采集和处理 |
| 2.2.7 SHIV-XJDC6431病毒感染恒河猴后病毒学指标检测 |
| 2.2.7.1 SHIV病毒RNA载量测定 |
| 2.2.7.2 SHIV病毒感染恒河猴后细胞学指标检测 |
| 2.2.7.3 SHIV病毒分离 |
| 2.2.7.4 SHIV病毒在猴体内的核酸鉴定及序列分析 |
| 2.2.8 SHIV-XJDC6431病毒感染恒河猴后特异性结合抗体滴度测定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一节 表达中国HIV-1毒株env基因的SHIV构建 |
| 3.1.1 全长SHIV克隆的构建流程 |
| 3.1.2 外源片断目的基因的获得 |
| 3.1.3 从血样中获得HIV-1 env基因的半长SHIV克隆的筛选和鉴定 |
| 3.1.4 从质粒中获得HIV-1 env基因的半长SHIV克隆的筛选和鉴定 |
| 3.1.5 携带不同中国HIV-1毒株env基因的全长SHIV克隆的构建和鉴定 |
| 3.1.6 包含中国HIV-XJDC6431毒株env基因的全长SHIV克隆的构建和鉴定 |
| 第二节 细胞水平筛选有复制能力的SHIV全长克隆及部分SHIV毒株体外感染活性的比较 |
| 3.2.1 在TZM细胞中具有感染能力SHIV的筛选 |
| 3.2.2 在恒河猴淋巴细胞中筛选具有感染能力的SHIV病毒 |
| 3.2.3 SHIV病毒在人淋巴细胞(PBMC)中复制能力的检测 |
| 3.2.4 SHIV-XJDC6431在细胞水平生物学活性分析 |
| 3.2.4.1 SHIV-XJDC6431病毒颗粒的电镜观察 |
| 3.2.4.2 SHIV-XJDC6431的细胞嗜性检测 |
| 3.2.4.3 SHIV-XJDC6431在恒河猴PBMC中的细胞病变观察 |
| 3.2.4.4 SHIV-XJDC6431与多株SHIV嵌合病毒在恒河猴CD4~+淋巴细胞中的感染活性比较 |
| 3.2.4.5 DNA PCR检测SHIV在猴CD4~+T细胞中的整合 |
| 3.2.4.6 SHIV-XJDC6431与多株SHIV嵌合病毒在人淋巴细胞中的感染活性比较 |
| 3.2.4.7 SHIV-XJDC6431的亚型分类及env区的序列分析 |
| 第三节 SHIV-XJDC6431在恒河猴体内感染活性的检测 |
| 3.3.1.SHIV-XJDC6431病毒颗粒的制备 |
| 3.3.2 攻毒实验中使用恒河猴的筛选 |
| 3.3.3 感染途径及观察指标 |
| 3.3.4 血浆SHIV-XJDC6431病毒RNA载量检测 |
| 3.3.5 CD4细胞计数和CD4/CD8比值分析 |
| 3.3.6 SHIV-XJDC6431感染后病毒的cDNA PCR鉴定 |
| 3.3.7 血清中HIV-1特异性结合抗体检测 |
| 3.3.8 SHIV-XJDC6431在猴体内的传代实验 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 人类的无奈选择—人造病毒SHIV |
| 4.1.1 具有代表性SHIV的总结 |
| 4.1.2 SHIV嵌合病毒在恒河猴模型中的应用 |
| 第二节 得到感染性SHIV嵌合病毒成功的关键 |
| 4.2.1 SHIV病毒骨架及HIV-1外源片断的选择 |
| 4.2.2 恒河猴种属差异及病毒—宿主关系 |
| 4.2.3 病毒在体内的适应过程—通过猴体传代得到致病株 |
| 第三节 SHIV的发展何去何从 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）基于全长基因组的HIV-1 CRF07BC毒株流行特征及病毒基因功能研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CRF07_BC毒株基因组全长序列特征、进化与毒株传播关系 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 新疆地区CRF07_BC毒株gag基因P6区段氨基酸缺失的分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 CRF07_BC感染性克隆构建及其基因改造 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述:HIV-1辅助蛋白与病毒复制 |
| 致谢 |
| 个人基本情况与发表文章 |
（9）我国部分地区HIV-1毒株的分离培养与基因序列特征研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 我国部分地区HIV-1 流行株的分离培养 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 我国部分地区HIV-1 分离株的基因型分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 一株CRF08_BC 重组毒株和一株G 亚型毒株的全基因组序列分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 HIV 感染分子机制及其防治研究现状 |
| 1 AIDS/HIV 的流行情况 |
| 2 HIV 病原学 |
| 3 HIV 感染与致病分子机制 |
| 4 HIV 的进化与变异 |
| 5 AIDS/HIV 防治研究现状 |
| 6 问题与展望 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂与免疫治疗研究进展 |
| 1 AIDS 靶向治疗的历史、原理及研究现状 |
| 2 AIDS 靶向治疗运载工具研究 |
| 3 AIDS 靶向治疗生物弹头研究 |
| 4 AIDS 新的免疫治疗策略研究 |
| 5 问题与展望 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新型抗病毒基因西诺维恩、格瑞弗森的合成构建、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂CS、GS 的构建及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组抗病毒蛋白及其导向制剂的纯化与复性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 HIV-1 感染靶细胞模型的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂在酵母中表达探索研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析（论文参考文献）
- [1]用于评价中和抗体广谱性的HIV-1假病毒系统的构建[D]. 黄芳. 厦门大学, 2019(09)
- [2]云南省HIV-1感染者中HCV、HHVs的感染和流行特征研究[D]. 杨舒婷. 昆明理工大学, 2019(04)
- [3]人类免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp140三聚体免疫原改造优化及其抗体筛选[D]. 沈鸿霖. 厦门大学, 2019(09)
- [4]我国HIV-1流行毒株的分离鉴定及Rev蛋白第101位提前终止的生物效应研究[D]. 韩婧婉. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(08)
- [5]浙江省2004-2011年HIV-1流行毒株的传播和进化研究[D]. 姚亚萍. 浙江大学, 2013(03)
- [6]HIV-1潜伏的人Jurkat T细胞模型的建立及中国流行株HIV-1 B/C重组亚型感染人脐带血造血祖细胞的研究[D]. 李琳. 复旦大学, 2010(03)
- [7]携带中国CRF07BC HIV-1毒株env基因的嵌合病毒SHIV构建及体内外生物学活性检测[D]. 李悦. 南开大学, 2009(11)
- [8]基于全长基因组的HIV-1 CRF07BC毒株流行特征及病毒基因功能研究[D]. 孟哲峰. 中国疾病预防控制中心, 2008(10)
- [9]我国部分地区HIV-1毒株的分离培养与基因序列特征研究[D]. 苗文泉. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [10]新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究[D]. 李昌. 吉林大学, 2008(11)