沙门氏菌sRNA GcvB调控基因筛选

论文摘要

为研究沙门氏菌（Salmonella）中重要的调控因子小RNA GcvB（small RNA,sRNA）对细菌的生存、毒力以及致病性的影响,筛选GcvB可能调控的靶基因。本研究采用高通量的转录组测序（RNA-seq）技术对沙门氏菌LT2标准株和沙门氏菌LT2 gcvB基因缺失株的mRNA进行对比分析,全面的预测GcvB的调控基因数量与种类。使用GO和KEGG等数据库进行信息学分析,结合Target RNA2预测其相互作用位点,对筛选出的表达差异最大的Top10基因、ABC转运蛋白通路部分基因、Target RNA2预测部分基因进行荧光定量PCR验证,进一步分析筛选基因的主要功能及涉及的生物学过程。结果如下:1.沙门氏菌gcvB基因缺失株鉴定与生长曲线测定采用PCR方法对沙门氏菌LT2标准株及沙门氏菌LT2 gcvB基因缺失株进行鉴定,结果显示gcvB基因序列被cat基因序列替换,小RNA GcvB已被敲除。采用比浊法测定两株细菌的生长曲线,结果显示沙门氏菌LT2标准株在6 h时进入对数期,在沙门氏菌LT2 gcvB缺失株3h时进入对数期,两株菌株在12 h时进入平台期,表明小RNA GcvB缺失后细菌的生长代谢受到影响。2.沙门氏菌gcvB基因缺失株转录组测序分析采用RNA-seq技术对沙门氏菌LT2标准株及沙门氏菌LT2 gcvB基因缺失株进行转录组测序分析,结果显示差异表达基因共1244个,其中基因表达上调678个、表达下调566个,Top10差异表达上调基因:STM1131、sicA、pduD、pduC、prgK,下调基因:nirB、narG、napF、napD、STM2344,非显著差异基因3116个。采用KEGG与GO数据分析方法对测序数据进行分析,KEGG数据库分析结果显示,差异表达基因主要参与细菌趋化性、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路;GO数据库分析结果显示,差异表达基因主要涉及细菌鞭毛的细胞成分,氧化还原活性、铁离子结合等分子功能,细胞呼吸、钴胺素代谢过程等生物过程。采用GO与KEGG数据分析方法对ABC转运蛋白通路中13个基因和Target RNA2预测的7个基因进行分析,结果显示基因涉及锰/铁转运系统通透酶蛋白、精氨酸转运系统底物结合蛋白等信号通路;细胞质、硝酸盐等细胞成分,金属离子结合、多胺结合等分子功能,无氧呼吸、氨基酸运输等生物过程。3.沙门氏菌sRNA GcvB调控基因筛选采用荧光定量PCR方法对Top10差异表达基因、ABC转运蛋白通路中的13个基因、Target RNA2预测的7个基因进行验证,结果显示30个基因的上下调趋势与RNA-seq测序结果一致。上述研究结果表明,在敲除小RNA GcvB条件下,沙门氏菌的生长代谢发生了复杂的变化,在RNA-seq转录组测序的基础上,运用荧光定量PCR方法筛选得到小RNA GcvB可能的调控基因30个,为进一步探明小RNA GcvB与调控基因相互作用,小RNA的调控机理以及沙门氏菌致病机制奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 文献综述
•   1 沙门氏菌非编码小RNA
•     1.1 小RNA的发现及作用
•     1.2 小RNA的分类以及对基因的调控方式
•       1.2.1 小RNA的分类
•       1.2.2 小RNA对基因的调控方式
•       1.2.3 伴侣蛋白Hfq的作用
•     1.3 沙门氏菌小RNA GcvB
•       1.3.1 沙门氏菌小RNA GcvB的结构特点
•       1.3.2 沙门氏菌小RNA GcvB作用机制
•   2 RNA-seq技术
•     2.1 RNA-Seq测序流程
•     2.2 RNA-Seq数据处理
•       2.2.1 数据组装与读长定位
•       2.2.2 基因表达水平估计及差异分析
•       2.2.3 基因功能分析
•   3 RNA-Seq在细菌研究中的应用
•   4 研究目的与意义
• 试验研究
•   1 材料
•     1.1 实验菌株
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 沙门氏菌gcvB基因缺失株验证
•       2.1.1 引物设计
•       2.1.2 细菌DNA提取
•       2.1.3 目的基因扩增
•     2.2 沙门氏菌gcvB基因缺失株生长曲线测定
•     2.3 沙门氏菌gcvB基因缺失株转录组测序分析
•       2.3.1 RNA-Seq测序的样品准备
•       2.3.2 RNA的提取与检测
•       2.3.3 文库构建与测序
•       2.3.4 测序数据的处理与分析
•       2.3.5 差异表达基因筛选
•       2.3.6 差异表达基因的GO和 KEGG富集分析
•     2.4 沙门氏菌gcvB基因缺失株Top10 差异表达基因验证
•       2.4.1 引物设计
•       2.4.2 Top10 差异表达基因PCR扩增
•       2.4.3 Top10 差异表达基因验证
•     2.5 沙门氏菌gcvB基因缺失株TargetRNA2 预测基因验证
•       2.5.1 引物设计
•       2.5.2 TargetRNA2 预测基因PCR扩增
•       2.5.3 TargetRNA2 预测基因验证
•     2.6 沙门氏菌gcvB基因缺失株ABC转运蛋白通路基因验证
•       2.6.1 引物设计
•       2.6.2 ABC转运蛋白通路基因PCR扩增
•       2.6.3 ABC转运蛋白通路基因验证
•   3 结果
•     3.1 沙门氏菌gcvB基因缺失株鉴定
•     3.2 沙门氏菌gcvB基因缺失株生长曲线
•     3.3 沙门氏菌gcvB基因缺失株转录组测序分析
•       3.3.1 RNA的提取与检测
•       3.3.2 测序数据过滤
•       3.3.3 测序数据参考基因组比对
•       3.3.4 测序数据与参考基因集比对及评估
•       3.3.5 基因表达量分析
•       3.3.6 差异表达基因分析
•       3.3.7 Top10 差异表达基因KEGG与 GO分析
•       3.3.8 TargetRNA2 预测基因KEGG与 GO分析
•       3.3.9 ABC转运蛋白通路基因KEGG与 GO分析
•     3.4 沙门氏菌gcvB基因缺失株Top10 差异表达基因验证
•       3.4.1 Top10 差异表达基因PCR鉴定
•       3.4.2 Top10 差异表达基因验证
•     3.5 沙门氏菌gcvB基因缺失株TargetRNA2 预测基因验证
•       3.5.1 TargetRNA2 预测基因PCR鉴定
•       3.5.2 TargetRNA2 预测基因验证
•       3.5.3 小RNA GcvB作用位点预测
•     3.6 沙门氏菌gcvB基因缺失株ABC转运蛋白通路基因验证
•       3.6.1 ABC转运蛋白通路基因PCR鉴定
•       3.6.2 ABC转运蛋白通路基因验证
•   4 讨论
•     4.1 关于沙门氏菌gcvB基因缺失株转录组分析
•     4.2 关于沙门氏菌gcvB基因缺失株Top10 差异表达基因分析
•     4.3 关于沙门氏菌gcvB基因缺失株TargetRNA2 预测基因分析
•     4.4 关于沙门氏菌gcvB基因缺失株ABC转运蛋白通路基因分析
• 全文结论
• 参考文献
• 附录一 攻读研究生期间参与发表文章
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘丽娟

导师: 周碧君,杨琦

关键词: 差异表达基因,作用位点,调控基因

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 贵州大学

基金: 国家自然科学基金(青年基金)项目:沙门氏菌中sRNAGcvB以及伴侣蛋白Hfq对STM4351基因的调控机理研(编号:31602065),国家自然科学基金(地区基金)项目:沙门氏菌中伴侣蛋白Hfq与小RNA的相互作用方式以及对靶基因的调控机理分析(编号:31760740)

分类号: S852.61

总页数: 84

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