浙江省温州市人民医院病理科325000
摘要：目的：分析DNA倍体和P53与乳腺浸润性导管癌临床病理学因素（患者年龄、肿瘤大小、临床病理分期、组织学分级、分子分型、淋巴结转移情况、有无癌栓）的相关性，并探讨P53与DNA倍体的相关性，从而为乳腺癌的诊断和治疗提供依据。方法：收集XX医院2015年9月至2016年4月间乳腺肿瘤患者112例，采用细胞DNA自动检测分析仪测定细胞核DNA含量，采用免疫组化的方法检测P53，分析DNA倍体和P53与乳腺浸润性导管癌临床病理学因素的相关性以及DNA倍体与P53的关系。结果：良性肿瘤、导管内癌、浸润性导管癌三组的DNA异倍体率进行比较，差异具有统计学意义（χ2=48.823，P<0.001）。P53蛋白阳性表达与肿瘤组织分级有关（χ2=28.439，P<0.001）。P53蛋白阳性表达细胞中DNA含量高于P53蛋白阴性表达细胞（t=2.18，P=0.033）采用spearman’s秩相关进一步分析P53蛋白表达与DNA含量的相关性，结果表明P53蛋白（r=0.753，P<0.01）表达与DNA含量呈正相关。结论：恶性肿瘤中DNA倍体率明显高于良性肿瘤，提示细胞DNA定量对肿瘤良恶性鉴别有重要价值。DNA含量与组织分级和分子分型有关，组织分级越高，DNA含量越高，提示肿瘤的恶性度越高。P53阳性表达与组织分级、分子分型及淋巴结转移有关；DNA含量越高和P53阳性表达与乳腺癌患者的年龄，肿瘤大小、临床病理分期和有无癌栓无关。
关键词：乳腺癌DNA倍体：P53：临床病理：相关性
DNA整倍体是指被检测细胞的DNA含量是二倍体细胞DNA含量的整数倍[1]，而非整倍体则是二倍体细胞的非整数倍。通常将DNA非整倍体称为DNA异倍体。P53基因是一种肿瘤抑癌基因，位于第17号染色体长臂13.1区域，分子量为53KD，能够调控细胞周期和诱导细胞凋亡。研究发现P53突变基因存在于多种肿瘤组织中，如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等[3，4-7]。据统计国外约有15%-71%的乳腺癌患者存在P53基因突变[8]，国内P53在乳腺癌患者中的阳性表达率平均约为45%[9]。然而，乳腺癌患者P53基因表达与临床病理的相关性国内外尚无统一结论。鉴于DNA倍体和P53与肿瘤的发生有一定的关联，本研究的目的是分析DNA倍体和P53与乳腺癌临床病理学特征（患者年龄、肿瘤大小、临床病理分期、组织学分级、分子分型、淋巴结转移情况、有无癌栓等）的相关性，并探讨P53、DNA倍体的相关性，从而为乳腺癌的诊断和治疗提供依据。
材料和方法
1病例标本
收集XX医院2015年9月至2016年4月间乳腺肿瘤患者112例，其中良性肿瘤患者30例（乳腺纤维腺瘤18例、导管内乳头状瘤2例、乳腺增生症10例、），恶性肿瘤患者82例（导管内癌16例、浸润性导管癌66例）。其中，66例乳腺浸润性导管癌患者均有完整的临床病理资料，且术前均未曾接受放疗和化疗。
2.方法
2.1细胞DNA定量分析
术中冰冻送检乳腺标本沿最大面切开，肉眼观察典型的病变区，用载玻片轻触压病变区，制成印片1张，将细胞印片风干后进行Feulgen染色，染色具体步骤如下：1.95%无水乙醇10分钟；2.无水乙醇15分钟；3.B.S液15分钟；4.水漂洗5-6次；5.5N盐酸60分钟；6.水漂洗5-6次；7.DNA染液67分钟；8.水漂洗5-6次；9.无水乙醇8分钟10.晾干，封片，贴标签。将Feulgen染色片置于DNA-ICMII的显微镜载物台上，人工调试到20X的物镜上，自动扫描和聚焦，将载玻片上有细胞的部分，划分成1080个小区域，逐一区域扫描，并记录扫描数据；以同一玻片上100个正常上皮细胞或部分淋巴细胞核DNA含量作为正常2倍体（2c）参照细胞，其CV（变异系数）值小于5%，AcCell系统根据不同细胞成分具有的不同特征参数来自动完成细胞分类和计数过程，如正常上皮细胞、增生或癌变细胞、淋巴细胞、中性白细胞。分析细胞数>1000个，并在镜下剔除严重退变细胞、重叠细胞和细胞碎片、杂质等非检测目标，完成检测，扫描完成后，系统自动绘制横轴为IOD（IntegratedOpticalDensity）值、纵轴为细胞核面积分布图，以及横轴为IOD值，纵轴为细胞数量的DNA含量分布直方图，并同时给出了平均DI值（DNAindex）、标准差、变异系数，并显示扫描细胞DNA含量最高的前20例细胞的IOD值。
2.1.1结果判读
根据ACCell系统诊断软件所做的细胞DNA倍体分析结果和建议有如下三种情况：1.正常2倍体（DNA定量为2C）细胞为主，未见异倍体细胞及异倍体峰诊断为正常。2.4C细胞大于被测细胞总数的5%，但未见异倍体细胞，诊断为增生。3.出现3个或3个以上>5C的细胞或出现异倍体细胞峰，诊断为阳性。
2.1.2ICM分析系统特定的参数：
细胞DNA自动检测分析仪（ICM）是通过测定染色细胞核的IOD值来判断核的DNA相对含量，IOD也叫吸光光密度。常用DNA指数来表示DNA含量，DNA指数（DI）=被测细胞DNAIOD值/标准细胞DNA（G0/G1）IOD平均值。全自动DNA倍体分析系统能自动测出不正常上皮细胞的DI均值，并且设定DI在1-2之间为正常。
2.2免疫组化检测
2.2.1EnVision法染色（P53）采用EnVision两步法，DAB显色。具体步骤如下：（1）切片：石蜡标本经切片机连续4um厚切片，阳离子防脱片捞片后置于60摄氏度烤箱中2小时。（2）脱蜡：依次将切片放入二甲苯及梯度酒精中脱蜡（100%－100%－95%－90%－80%－70%）。每个试剂放10分钟。（3）抗原修复：蒸馏水冲洗，加入3%H2O2浸泡10分钟，在蒸馏水中洗3次，再PBS洗3次，每次3分钟。再加入EDTA，放入高压锅中蒸煮2分半。取出后自来水冲洗10分钟，蒸馏水洗3次，PBS洗3次，每次3分钟。（4）加一抗：加入一抗后于4摄氏度冰箱中保存过夜。（5）加二抗：PBS中洗3次，每次3分钟，加上二抗，置于37摄氏度温箱中半小时。（6）加显色剂：PBS中洗3次，每次3分钟，加上显色剂。（试剂C11滴加C21ml）。期间显微镜下观察切片显色情况。（7）复染：先用清水洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色半分钟。（8）脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将切片放入梯度酒精中，每个放置2分钟，最后浸泡在二甲苯中。（9）封片：用中性树胶封片。实验中用已知P53阳性的高级别的卵巢浆液性乳头状囊腺癌做为阳性对照。
2.2.2结果判读
P53的判读：P53蛋白定位在细胞核上，出现弥漫强阳性时视为（+），散在细胞阳性或细胞阳性强弱不等时均视为阴性。
2.3统计学方法
采用以SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差来表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析；计数资料以率来表示，多组比较采用χ2检验。变量间相关性分析采用Spearman’s秩相关。P<0.05为认为差异具有统计学意义。
3.结果
良性肿瘤、导管内癌、浸润性导管癌三组的DNA异倍体率进行比较，差异具有统计学意义（χ2=48.823，P<0.001），见表1。浸润性导管癌组织中的DNA异倍体率高于导管内癌组织（χ2=7.208，P=0.007）和良性肿瘤组织（χ2=45.672，P<0.001），导管内癌组织中的DNA异倍体率高于良性肿瘤组织（χ2=7.109，P=0.008）。
4.讨论
DNA倍体是衡量细胞核中DNA含量的客观指标，一般DNA含量越高，染色体越不稳定，细胞恶性程度越高。乳腺癌发生及发展中细胞核内的染色体发生改变，最终形成非整倍体的肿瘤。而依据腺管形成多少、细胞异型性程度、核分裂像多少的变化可将肿瘤组织分为Ⅰ级（低度恶性）、Ⅱ级（中度恶性）、和Ⅲ级（高度恶性）[10]。核的异型性越大，肿瘤的非整体越多，则恶性度就越高，其组织学分级也就越高。Martinez-Arribas[38]等人对280例乳腺癌患者进行研究，发现DNA含量与组织学分级存在相关性。Michel[11]分析了607例乳腺癌患者的DNA，结果表明DNA异倍体与组织学分级显著相关。Cufer[34]等人研究同样发现了DNA倍体与组织学之间的相关性（P<0.0001），证实DNA含量可反应乳腺癌的分化程度。王成[12]等人分析了72例浸润性导管癌患者的DNA含量（DI值）与组织学分级的关系，发现不同分级的浸润性导管癌患者的DNA含量差异具有统计学意义（P<0.05）本研究也证实了这一观点。
5.结论
恶性肿瘤中DNA倍体率明显高于良性肿瘤，提示细胞DNA定量对肿瘤良恶性鉴别有重要价值。
DNA含量与组织分级和分子分型有关，组织分级越高，DNA含量越高，提示肿瘤的恶性度越高。DNA含量与乳腺癌患者的年龄，肿瘤大小、临床分期、有无癌栓及腋窝淋巴结转移无关；P53阳性表达与组织分级、分子分型及淋巴结转移有关；与乳腺癌患者的年龄，肿瘤大小、临床病理分期和有无癌栓无关。
参考文献：
[1]MuhonenT.ImprovingtheprognosticvalueofDNAflowcytometryinmetastaticmelanomabycombiningploidyandS-phasefraction.Melanomaresearch，1992，2（4）：247-252.中国公共卫生，2012（12）：1645-1648.
[2]郑艳敏，沈月平，刘银梅，等.中国女性乳腺癌危险因素Meta分析.中国公共卫生，2012（12）：1645-1648.
[3]HeXX，ZhangYN，YanJW，etal.CP-31398inhibitsthegrowthofP53-mutatedlivercancercellsinvitroandinvivo.Tumourbiology：thejournaloftheInternationalSocietyfor
OncodevelopmentalBiologyandMedicine，2016，37（1）：807-815.
[4]HegazyR，KamelM，SalemEA，etal.TheprognosticsignificanceofP53，p63andher2expressioninnon-muscle-invasivebladdercancerinrelationtotreatmentwithbacilliCalmette-Guerin.Arabjournalofurology，2015，13（3）：225-230.
[5]IwanickiMP，ChenHY，IavaroneC，etal.MutantP53regulatesovariancancertransformedphenotypesthroughautocrinematrixdeposition.JCIinsight，2016，1（10）.
[6]杜长征，李惠平，马力文，等.中国乳腺癌患者P53表达临床生物学意义的Meta分析.中国癌症杂志，2005（06）：514-517.
[7]CaleffiM，TeagueMW，JensenRA，etal.P53genemutationsandsteroidreceptorstatusinbreastcancer.Clinicopathologiccorrelationsandprognosticassessment.Cancer，1994，73（8）：2147-2156.
[8]OlivierM，HainautP.TP53mutationpatternsinbreastcancers：searchingforcluesof
environmentalcarcinogenesis.Seminarsincancerbiology，2001，11（5）：353-360.
[9]郭彦伟.P53基因在乳腺癌组织中的表达及与临床病理因素的关系.中国社区医师（医学专业半月刊），2009（08）：115-116.
[10]AlimirahF，PanchanathanR，DavisFJ，etalRestorationofP53expressioninhumancancercelllinesupregulatestheexpressionofNotch1：implicationsforcancercellfatedeterminationaftergenotoxicstress.Neoplasia，2007，9（5）：427-434.
[11]王成，李敏，蒋敏.乳腺浸润性导管癌DNA含量与组织学分级.青海医学院学报，2006（03）：156-158.
[12]AlimirahF，PanchanathanR，DavisFJ，etalRestorationofP53expressioninhumancancercelllinesupregulatestheexpressionofNotch1：implicationsforcancercellfatedeterminationaftergenotoxicstress.Neoplasia，2007，9（5）：427-434.