黄化与去黄化过程中拟南芥幼苗环化RNA表达与功能研究

论文摘要

环状RNA（circular RNA,circRNA）是由线性RNA的3’和5’末端连接起来形成的,区别于传统的线性RNA,是一种特殊的内源性RNA分子,因其结构不容易被RNA酶降解,因此比线性RNA更稳定。circRNAs可在生物体中以多种类型大量存在,具有调控基因表达的作用,其广泛性、保守性及组织特异性等性质都预示着它在未来可能成为一种新型的生物标志物。目前,已经在动物中鉴定了大量具有调节能力的非编码circRNAs,但在植物中的研究却很少。光是植物生长发育的最重要的环境因素之一,影响植物幼苗的形态建成、叶绿体的建成和光合作用等过程。本研究选取模式植物拟南芥为实验材料,通过高通量测序,生物信息学分析,并结合分子生物学的方法,对黄化与脱黄化拟南芥幼苗建成过程中circRNAs的表达情况进行深入研究。主要结果如下:（1）通过RNase R消化、高通量测序与生物信息学分析,共鉴定得到499个circRNAs分子,随机分布在拟南芥的1-5号染色体、线粒体基因和叶绿体基因组中。173个circRNAs来源于编码蛋白质的基因的外显子区域,27个来自于内含子区域,309个circRNAs来自于基因间区。共检测到485个是差异表达基因,与黄化拟南芥幼苗相比,脱黄化样本中有369个显著上调和116个显著下调的circRNAs。（2）GO和KEGG分析并注释circRNAs亲本基因的生物学功能,发现GO数据库中注释到与细胞代谢、刺激反应、质体/叶绿体组分、催化活性和蛋白质结合等重要功能;KEGG数据库中注释到与光合作用和碳代谢相关的重要代谢通路,表明circRNAs可能参与了光调控的拟南芥脱黄化过程中。此外,发现33个circRNAs具有miRNA的结合位点,并且circRNAs与miRNA结合方式多种多样,表明在拟南芥中一些circRNAs是潜在的miRNA靶标。因此,植物circRNAs可能通过与miRNA相互作用在基因表达调控中发挥作用。（3）高通量测序鉴定出10个circRNAs从叶绿体基因组中形成,分布有外显子、内含子和基因间区;其中有6个circRNAs来自蛋白质编码基因,分布在叶绿体基因组的LSC和SSC区;只有athcirc477和athcirc481的反向剪接位点是传统的剪接位点,具有GT/AG信号。（4）使用数字PCR优化低丰度circRNAs的检测方法,在叶绿体中共鉴定出四个cp-circRNAs,分别是ath circ 476,ath circ477,athcirc478和athcirc480。与RNA-seq结果相似,ath circ476在黄化拟南芥幼苗中的表达量上调,ath circ 477,athcirc478和athcirc480在脱黄化拟南芥幼苗中的表达量上调。检测ath circ 476的亲本基因ycf5的表达,发现在从幼苗的暗形态建成到光形态的过程中,ycf5和ath circ 476显著下调。差异表达的亲本基因与相应的circRNA具有共同的表达趋势,表明在黄化幼苗中二者存在共表达的模式。（5）有5个circRNAs参与了光合作用,由Rubisco小亚基的RBCS-1B、RBCS-2B和RBCS-3B编码基因构成。通过线状扩增引物和环状扩增引物引物和sanger测序,验证出由RBCS-2B的exon4与exon5,和RBCS-3B的exon3构成的反义环状RNA,即circRBCS。发现circRBCS在根中没有表达,在可进行光合作用的组织中均有表达,在叶中表达量最高,与亲本基因RBCS的组织表达相似。黑暗下生长三天的拟南芥幼苗,随着光照时间的延长,circRBCS和亲本基因RBCS的表达量逐渐增加,并且表达趋势一致,猜测circRBCS可能与亲本基因有共表达,可能在转录水平上调节亲本基因。（6）构建拟南芥circRBCS过表达株系,获得了阳性株系4株,发现circRBCS的表达量增加并未导致RBCS表达的增加;表型分析发现,未发现明显的表型变化。可能由于过表达载体的构建不适合植物体。综上所述,本研究以拟南芥col为材料,通过高通量测序、生物信息学分析和分子生物学手段,对幼苗建成过程中的circRNAs表达分析进行研究,揭示了拟南芥叶绿体中存在稳定表达的circRNAs,并且光合作用过程有circRNAs的参与,可能参与亲本基因的表达调控,为进一步揭示circRNAs在植物中的功能提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 1 引言
•   1.1 环状RNA
•   1.2 circRNAs的发现
•     1.2.1 下一代测序技术
•     1.2.2 Ribonuclease R
•     1.2.3 circRNAs的生物信息学检测
•   1.3 circRNAs的生物起源与形成机制
•     1.3.1 首尾拼接和Pol Ⅱ转录偶联调节circRNAs的生物起源
•     1.3.2 核心剪接复合体调节circRNAs的生物起源
•     1.3.3 顺式元件调节circRNAs的生物起源
•     1.3.4 RBPs调节circRNAs生物起源
•     1.3.5 circRNAs的周转
•   1.4 circRNAs的功能
•     1.4.1 circRNAs在生理和病理条件下的作用
•     1.4.2 circRNAs的加工影响其线性同源物的剪接
•     1.4.3 细胞核中circRNAs调节转录和剪接
•     1.4.4 Micro RNA的海绵效应
•     1.4.5 调节结合蛋白质的活性
•     1.4.6 指导蛋白质的合成
•     1.4.7 驱动假基因的生成
•     1.4.8 生物标志物
•   1.5 植物circRNAs
•     1.5.1 circRNAs的检测
•     1.5.2 植物circRNAs的生物起源
•     1.5.3 植物circRNAs的功能
•       1.5.3.1 Micro RNA的海绵效应
•       1.5.3.2 参与应激反应
•       1.5.3.3 调控亲本基因表达
•       1.5.3.4 生物标志物
•   1.6 本论文的研究意义与研究内容
•     1.6.1 研究目的与意义
•     1.6.2 研究内容
• 2 拟南芥暗/光形态建成中环状RNA表达模式的研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验材料
•       2.1.1.1 植物材料
•       2.1.1.2 主要试剂
•       2.1.1.3 实验设备与仪器
•     2.1.2 实验方法
•       2.1.2.1 RNA提取
•       2.1.2.2 制备circRNA文库
•       2.1.2.3 聚类和排序
•       2.1.2.4 数据分析
•       2.1.2.5 差异表达分析
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 circRNAs测序基本数据分析
•     2.2.2 circRNAs的识别
•     2.2.3 circRNAs的差异表达分析
•       2.2.3.1 circRNAs的筛选
•       2.2.3.2 GO富集分析
•       2.2.3.3 KEGG代谢通路分析
•     2.2.4 miRNA结合位点分析
•   2.3 结论与讨论
•   2.4 小结
• 3 拟南芥叶绿体环状RNA的检测
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•       3.1.1.1 植物材料
•       3.1.1.2 主要试剂
•       3.1.1.3 实验设备与仪器
•     3.1.2 实验方法
•       3.1.2.1 RNA提取
•       3.1.2.2 cDNA合成
•       3.1.2.3 探针和引物设计
•       3.1.2.4 数字PCR
•       3.1.2.5 数据统计
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 拟南芥中叶绿体circRNAs的测序
•     3.2.2 数字PCR验证cp-circRNAs
•     3.2.3 黄化和脱黄化幼苗中cp-circRNAs的定量
• circ₄76及其亲本基因ycf5的定量'>    3.2.4 Ath_circ₄76及其亲本基因ycf5的定量
•   3.3 结论与讨论
•   3.4 小结
• 4 拟南芥circRBCS的表达分析与功能研究
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料
•       4.1.1.1 植物材料
•       4.1.1.2 工程菌株
•       4.1.1.3 质粒
•       4.1.1.4 实验设备与仪器
•       4.1.1.5 主要试剂及配置
•     4.1.2 实验方法
•       4.1.2.1 植物总DNA的提取
•       4.1.2.2 RNA提取
•       4.1.2.2 cDNA的合成
•       4.1.2.3 circRNAs的PCR检测
•       4.1.2.4 circRNAs的荧光定量PCR检测
•       4.1.2.5 目的基因的克隆与纯化
•       4.1.2.6 植物表达重组质粒的构建
•       4.1.2.7 农杆菌感受态的制备与转化
•       4.1.2.8 拟南芥稳定遗传转化及转基因植株的筛选
•       4.1.2.9 图像与数据分析
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 RBCS基因的反义circRNAs
•       4.2.1.1 RBCS基因的反义circRNAs的验证
•       4.2.1.2 反义circRBCS的形成过程
•       4.2.1.3 反义circRBCS的组织特异性表达
•       4.2.1.4 光照对RBCS和circRBCS表达的影响
•       4.2.1.5 不同光受体突变体RBCS和circRBCS的表达
•     4.2.2 拟南芥circRBCS过表达分析
•       4.2.2.1 circRBCS过表达植株的鉴定
•       4.2.2.2 过表达植株的circRBCS和RBCS表达
•       4.2.2.3 过表达植株的表型分析
•   4.3 结论与讨论
•   4.4 小结
• 5 circRNAs的体外合成
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验材料
•       5.1.1.1 植物材料
•       5.1.1.2 实验设备与仪器
•       5.1.1.3 主要试剂及配置
•     5.1.2 实验方法
•       5.1.2.1 RNA提取
•       5.1.2.2 cDNA的合成
•       5.1.2.3 DNA模板制备
•       5.1.2.4 体外转录
•       5.1.2.5 纯化与鉴定
•       5.1.2.6 体外环状
•       5.1.2.7 环状RNA回收
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 转录模板DNA的制备
•     5.2.2 转录
•     5.2.3 RNA环状
•     5.2.4 环状的鉴定
•   5.3 结论与讨论
•   5.4 小结
• 6 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录清单
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘帅

导师: 万迎朗

关键词: 叶绿体,光形态建成,暗形态建成,数字

来源: 北京林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 北京林业大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.26949/d.cnki.gblyu.2019.000018

总页数: 114

文件大小: 6925K

下载量: 130