AAV-SaCas9-sgRNA腺相关病毒的包装及其对Balb-c小鼠MSTN基因的敲除

论文摘要

基因组编辑技术（genome editing）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术,是研究基因功能最重要的方法之一。对于机体内部的基因编辑需要转运载体,由于非病毒载体的转染效率比较低,因此急需找到一种高效且安全的病毒转运载体。AAV载体被视为最有发展潜力的病毒载体,具有不整合到宿主基因组、免疫原性较低、无致病性等优点,但是其承载量较小（约4.7 kb）。CRISPR-Cas9技术作为一种操作简单、灵活性好、切割效率高的基因编辑技术,可用于基因治疗。最初发现的SpCas9片段较大（约4.2 kb）,后来发现了约3.2 kb的SaCas9,使AAV介导CRISPR-Cas9系统发挥作用成为可能。MSTN是一种能够负调控肌肉生长的调控因子,该基因的功能缺失会引起肉用动物的双肌表型,从而提高产肉率。目前对MSTN潜在功能及其调控机制还了解较少,为了进一步研究MSTN的作用机制,本研究进行了以下试验:1、本试验首先设计3个靶向MSTN基因的sgRNA,构建pX601-SaCas9-sgRNA重组载体。利用小鼠胚胎成纤维细胞系（NIH3T3）和人肾上皮细胞系（HEK293）,以T7 EI酶切法和测序法检测基因编辑效率,同时以Western blot鉴定MSTN蛋白的敲除效率。2、将 pX601-SaCas9-sgRNA与病毒辅助质粒 pAAV9-RC、pAAV9-helper 进行 AAV 病毒的包装,分离纯化重组AAV病毒并以QPCR法检测病毒滴度。3、将重组AAV病毒感染NIH3T3细胞,5 d后,以T7 EI酶切法和测序法检测基因编辑效率,同时以Western blot鉴定MSTN蛋白的敲除效率。4、重组AAV病毒感染Balb-c小鼠,6周后取腿部骨骼肌,以石蜡切片结合HE染色法观察肌纤维形态变化,并提取基因组DNA,以T7 EI酶切法和测序法检测基因编辑效率,同时以Western blot鉴定MSTN蛋白的敲除效率。结果表明:1、成功构建了靶向MSTN基因外显子的3个重组载体pX601-SaCas9-sgRNA1,pX601-SaCas9-sgRNA2,pX601-SaCas9-sgRNA3,证明其在细胞水平均能够对MSTN进行基因编辑,进而造成MSTN蛋白表达量下降。2、成功包装出 3 种重组AAV 病毒 AAV-SaCas9-sgRNA1,AAV-SaCas9-sgRNA2,AAV-SaCas9-sgRNA3,经测定滴度均大于 1010 vg/mL。3、包装出的3种重组AAV病毒在细胞上具有MSTN基因编辑能力,并能降低MSTN蛋白表达量。4、重组 AAV 病毐 AAV-SaCas9-sgRNA2,AAV-SaCas9-sgRNA3 成功感染小鼠,并对小鼠腿部肌肉的MSTN基因进行了编辑,降低了 MSTN蛋白的表达量,造成肌肉性状发生明显变化。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
•   1.1 CRISPR技术
•     1.1.1 CRISPR的发现及研究历史
•     1.1.2 CRISPR系统的结构特征
•     1.1.3 Cas蛋白的种类和应用
•     1.1.4 CRISPR-Cas9的工作原理及其应用进展
•       1.1.4.1 CRISPR-Cas9的工作原理
•       1.1.4.2 应用进展
•     1.1.5 SaCas9的发现和应用
•   1.2 AAV腺相关病毒载体
•     1.2.1 AAV的种类和结构
•     1.2.2 AAV载体的生产
•     1.2.3 AAV-Cas9的应用
•   1.3 MSTN基因的概述
•     1.3.1 MSTN基因的结构和特征
•     1.3.2 MSTN的作用机制
•     1.3.3 肌肉生长抑制素MSTN的生物学功能
•     1.3.4 Cas9在MSTN基因上的研究进展
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 试验所需细胞
•     3.1.2 感受态细胞和质粒
•     3.1.3 主要试剂
•     3.1.4 主要仪器设备
•     3.1.5 试剂配制
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 引物设计与合成
•       3.2.1.1 sgRNA引物设计与合成
•     3.2.2 pX601-SaCas9-sgRNA载体的构建
•       3.2.2.1 sgRNA引物退火
•       3.2.2.2 质粒酶切
•       3.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
•       3.2.2.4 胶回收
•       3.2.2.5 连接
•       3.2.2.6 感受态细胞的制备
•       3.2.2.7 转化
•       3.2.2.8 挑菌
•       3.2.2.9 菌液PCR鉴定
•       3.2.2.10 质粒提取
•     3.2.3 在细胞上检测基因编辑效率
•       3.2.3.1 细胞培养及转染
•       3.2.3.2 PEI转染
•       3.2.3.3 细胞基因组提取
•       3.2.3.4 PCR扩增及切胶纯化
•       3.2.3.5 T7 EI酶切检测
•       3.2.3.6 细胞蛋白质的提取
•       3.2.3.7 测蛋白浓度
•       3.2.3.8 Western blot
•     3.2.4 AAV重组病毒的包装
•       3.2.4.1 收集病毒
•       3.2.4.2 病毒纯化浓缩
•       3.3.4.3 病毒滴度的测定（QPCR法）
•       3.2.4.4 重组AAV病毒在NIH3T3细胞上的基因编辑能力检测
•     3.2.5 重组AAV病毒在小鼠体内的基因编辑能力检测
•       3.2.5.1 肌肉注射小鼠
•       3.2.5.2 石蜡切片制作
•       3.2.5.3 小鼠肌肉组织DNA的提取
•       3.2.5.4 小鼠骨骼肌蛋白提取
•       3.2.5.5 小鼠骨骼肌蛋白Western blot鉴定
• 4. 结果与分析
•   4.1 pX601-SaCas9-sgRNA重组质粒载体的构建
•     4.1.1 pX601质粒酶切结果
•     4.1.2 菌液PCR鉴定结果
•   4.2 pX601-SaCas9-sgRNA基因敲除效率鉴定
•     4.2.1 细胞水平上检测MSTN基因编辑效率
•     4.2.2 T7 EI酶切鉴定
•     4.2.3 测序鉴定
•     4.2.4 Western blot鉴定
•   4.3 AAV重组病毒包装
•     4.3.1 病毒滴度测定结果
•     4.3.2 AAV重组病毒感染细胞以鉴定敲除效率
•     4.3.3 Western blot鉴定
•     4.3.4 测序鉴定
•   4.4 AAV重组病毒感染小鼠
•     4.4.1 小鼠腿部肌肉形态学变化
•     4.4.2 T7 EI酶切鉴定
•     4.4.3 测序鉴定
•     4.4.4 Western blot鉴定
• 5. 讨论
• 参考文献
• 英文摘要

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王娟

导师: 王艳玲,兰尊海

关键词: 基因敲除

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000340

总页数: 46

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