表达FLAG标签融合VP1蛋白的重组IBDV拯救及其作为致弱疫苗候选株评估研究

论文摘要

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是一种由其病原体鸡传染性法囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）感染而引起的在雏鸡中急性并具有高度传染性和免疫抑制性的疾病。疫苗免疫是防控的主要手段,随着变异毒株（Variant IBDV）和高致病力的超强毒株（Very virulent IBDV,vvIBDV）的出现,开展新型疫苗株的构建研究十分必要。IBDV属双链RNA（dsRNA）病毒科（Birnaviridae）,其基因组由A、B二个节段dsRNA所组成。在本研究中,成功构建了一种高效的双启动子RNA polymerase（Pol I）-Pol II反向遗传系统,可以在无需VP1和VP3辅助的情况下完全从克隆的cDNA直接拯救重组IBDV。我们将IBDV-A44株A片段和B片段基因组分别克隆在真核表达载体pCI-neo的CMV启动子和polyA之间,构建IBDV感染性克隆p2-mA和p2-mB,直接转染293T细胞,72h后取上清继续在DF-1细胞上传代,直接拯救出与亲本毒有一致的复制动力学重组病毒。进一步,我们在VP1的C末端引入8-aa FLAG表位（DYKDDDDK）,得到表达FLAG标签的A44/FLAG拯救毒株。通过RT-PCR、间接免疫荧光、序列测定、Western-blot及透射电镜等均检测到了拯救的IBDV及融合表达的VP1蛋白FLAG标签。通过病毒空斑实验、复制动力学试验和SPF鸡攻毒试验,显示尽管与亲本病毒的病毒复制动力学具有相似的模式,但表达FLAG标签融合VP1的重组病毒在DF-1细胞系斑块表型显著减少,以及对法氏囊的损伤显著减少。此外,重组FLAG标记的IBDV具有与亲本毒株相当水平引发针对VP2的中和抗体的能力,并且在单次免疫时,赋予针对野生型IBDV的后续致死攻击的完全保护。总之,该研究表明,拯救的表达FLAG标签融合VP1的重组病毒可作为减毒活IBDV疫苗株;编码VP1的B区段基因中外源表位序列的靶向插入是用于设计减毒很好的策略,对探索IBDV分子致弱机制与研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 传染性法氏囊病
•   1.2 传染性法氏囊病病毒
•     1.2.1 病毒的分类和形态
•     1.2.2 血清型和理化性质
•     1.2.3 生物学特性和抵抗力
•     1.2.4 IBDV的基因组
•     1.2.5 IBDV的编码蛋白及其功能
•     1.2.6 IBDV的培养特性
•     1.2.7 流行病学
•     1.2.8 IBDV的诊断方法
•     1.2.9 IBDV的防治
•   1.3 IBDV反向遗传研究进展
•   1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 传染性法氏囊病病毒反向遗传拯救系统的建立
•   2.1 实验仪器和试剂
•     2.1.1 细胞、载体与菌株
•     2.1.2 分子生物学试剂
•     2.1.3 仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 IBDV全基因组真核表达载体的构建
•     2.2.2 拯救系统的建立及鉴定
•   2.3 实验结果
•   2.4 本章小结
• 第三章 拯救表达FLAG标签融合VP1 蛋白的重组IBDV
•   3.1 实验仪器和试剂
•     3.1.1 细胞、载体与菌株
•     3.1.2 分子生物学试剂
•     3.1.3 仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 构建p2-mBFlag和 p2-FlagmB
•     3.2.2 IBDV/Flag的拯救及鉴定
•   3.3 实验结果
•   3.4 本章小结
• 第四章 A44/FLAG毒株的形态学及致病性研究
•   4.1 实验仪器和试剂
•     4.1.1 细胞、毒株、实验动物
•     4.1.2 分子生物学试剂
•     4.1.3 仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 IBDV病毒的扩大培养以及浓缩
•     4.2.2 病毒纯化
•     4.2.3 动物实验
•     4.2.4 间接免疫荧光
•     4.2.5 法氏囊组织收样
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 电镜观察结果
•     4.3.2 动物实验结果
•   4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 个人简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王宇

导师: 刘合宾

关键词: 鸡传染性法氏囊病病毒,病毒复制,反向遗传,致弱活病毒,病毒拯救,疫苗株

来源: 浙江农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 浙江农林大学

分类号: S852.65;S852.4

总页数: 62

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