导读:本文包含了细胞内标记论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:标记,荧光,蛋白质,受体,细胞,量子,磁效应。
细胞内标记论文文献综述
苏循成[1]（2019）在《顺磁标记蛋白质在溶液与细胞内研究中的应用》一文中研究指出核磁共振中的顺磁效应,包括顺磁弛豫增强、赝接触位移和残余偶极耦合,是研究生物大分子结构、动态变化与相互作用的重要结构约束条件.定点顺磁标记大分子是获得该类结构约束的重要途径.本文论述了生物核磁中顺磁效应的基本原理,蛋白质定点顺磁标记路线和方法,以及在生物核磁中产生顺磁弛豫增强、赝接触位移和残余偶极耦合等顺磁效应的标签质量评价.在介绍该领域最新重要进展的基础上,本文主要讨论了本课题组通过利用顺磁效应在结构生物学和化学生物学中的工作:多结构域蛋白质中的结构域动态取向分析;非平衡态下低含量、不稳定蛋白质复合物的叁维结构测定;赝接触位移测定活细胞内蛋白质的叁维结构;顺磁核磁和电子自旋共振在结构生物学研究中的互补性以及应用双电子自旋共振在细胞内高分辨距离测定方法.顺磁定点标记蛋白质等生物大分子是获得该类大分子在近生理状态下高分辨动态结构与变化信息的重要方法,预计该技术会在细胞内研究中得到广泛应用.(本文来源于《中国科学:化学》期刊2019年11期）
杜阳春,唐菁兰,王友军,张晓嫣[2]（2019）在《活细胞内亚细胞结构蛋白质组学研究新技术——几种邻近标记策略的应用及比较》一文中研究指出真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的生物学功能及作用机制,并为研究细胞器相互作用提供基础.但由于无膜细胞器或膜接触位点很难分离纯化,传统的生化方法难以系统解析其中的蛋白质组.最近报道的几种基于酶类的蛋白质邻近标记技术,则为系统分析上述空间受限的蛋白质组这一难题提供了有效的解决方案.通过将能催化产生活性自由基(最常见的是生物素及其衍生物的自由基)的酶连接到目标蛋白上,可对其邻近的蛋白质组进行共价标记,从而使后者的分离和鉴定成为可能,并可以运用于活细胞中的动态标记.我们在此综述了几种最新的邻近标记策略的原理及应用,并对它们的优势与局限性进行了比较,以期为细胞器互作的蛋白质组学研究提供参考.(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2019年07期）
王鑫,蒋涛,刘俊维,陈长坡,仉华[3]（2018）在《苊醌-厄洛替尼click荧光后标记体系及其活细胞内药物视踪研究》一文中研究指出药物发现过程包括许多阶段,由于当前药物的研发成本居高不下,故此,新药研发迫切需要新技术、新理论。点击化学(Click chemistry),是通过小单元的拼接,来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法,并借助这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。点击化学的概念对化学合成领域有很大的贡献,在药物开发和生物医用材料等的诸多领域中,它已经成为目前最为有用和吸引人的合成理念之一[1]。本工作基于对药物在细胞内可视需求,以萘的衍生物苊醌为荧光母体,构筑强荧光类染料(FL-ATP),运用click反应的机理,构建可对药物专一性识别的荧光染料[2]。拟实现其对细胞内药物传递和运输过程中的识别与监控,并将其应用于药物细胞内视踪及药效评价中。在本工作中,对染料分子进行了基本光谱测定,明确了染料分子可与特定药物发生click反应,形成新的染料体系,借此实现细胞内视踪及药效评价。(本文来源于《河南省化学会2018年学术年会摘要集》期刊2018-09-28）
冷双[4]（2017）在《SNAP-tag荧光探针与细胞内蛋白标记应用研究》一文中研究指出蛋白质是细胞的重要组成部分,是生命活动的主要承担者。蛋白质的种类繁多,至今还有很多蛋白的性质未知,因此,对活细胞内蛋白质进行特异性荧光标记的技术应运而生。蛋白荧光标记技术因能够可视化的观测活细胞内蛋白质的结构与功能而被科学家们广泛应用。目前常用的蛋白荧光标记技术包括基因编码的荧光蛋白法、非天然氨基酸法和自标记蛋白标签技术。但是荧光蛋白存在分子量较大、荧光光谱单一等缺点,而非天然氨基酸法前期基因改造复杂使其应用存在一定的局限性。因此自标记蛋白标签技术被广泛的应用于研究活细胞中蛋白质的定位和动态功能。至今,已经开发了各种蛋白质标签以研究活体中的蛋白质系统,SNAP-tag是其中最优秀的融合标签之一。SNAP-tag是人源DNA烷基转移酶(hAGT)的变体,它能够专一性的与O6-苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine,BG)及其衍生物共价连接。目前,各种连接BG底物的荧光探针已被设计出来,而且能专一、快速、不可逆地与SNAP–tag共价连接,这使其广泛应用于药物监测、蛋白质-蛋白质相互作用、荧光传感器、和超分辨显微镜。虽然已经发现了很好的荧光探针,但是由于背景光较强这些探针需要在成像之前清除。这不仅耗费时间,而且这种清洗可能会影响实时监测一些分子内部的活动(例如受体-配体结合、内吞作用、物质运输等)。此外,因为多余的荧光探针容易在各种细胞器中堆积,我们很难做到完全清除。因此,为了克服这些困难,开发了新的具有开关效应的荧光探针。本文采用SNAP-tag蛋白标签技术,用新型的荧光探针标记体内的蛋白,能够在免洗的条件下实时监控蛋白在细胞内的分布。基于此,本论文主要做了以下工作:首先,基于荧光团的环境敏感与淬灭机制,我们设计合成了一系列基于1,8-萘酰亚胺荧光团的荧光探针BGAN-R(R=2C、8C、12C、DM)。通过荧光检测、动力学检测等一系列实验我们发现BGAN-2C能够快速、专一的与SNAP-tag共价反应,并且荧光显着增强。该探针细胞毒性小,在活细胞成像实验中,其能够快速地标记细胞内特定的蛋白质。随后,基于光诱导电子转移机制我们设计合成了BGAN-DPA探针。通过荧光检测、动力学等研究,发现BGAN-DPA与SNAP-tag蛋白结合后荧光显着增强。并且结合后的蛋白-探针复合物对铜离子有专一性响应。最后将BGAN-DPA应用到HEK 293细胞的生物成像研究中,在免洗条件下实现了细胞内线粒体上蛋白的标记及铜离子的检测。综上所述,通过设计合成的新型荧光探针,实现了SNAP-tag蛋白在细胞内的可视化追踪以及细胞内铜离子的检测,并且不需要任何洗涤过程。(本文来源于《大连医科大学》期刊2017-02-01）
刘佳蕙,高海迪,董益阳[5]（2016）在《高亮度碳量子点在细胞内的标记》一文中研究指出碳量子点(carbon-dots, C-Dots)是一类以碳为核心的,由于碳核表面缺陷造成的势垒,而具有优异荧光性能的新型纳米材料。C-Dots具有良好的生物相容性[1],可用于体内长期示踪研究;CDots具有高抗光漂白性,长荧光寿命和宽荧光光谱区域,可用于细胞内的高分辨共定位成像和长时间的动态观察研究。C-Dots的这些性质使得其在生物成像、示踪、药物载带等应用和研究中受到极大青睐[2]。碳量子点的尺寸通常只有几个纳米,未经修饰可以有一定的荧光量子产率,经氨基末端的高分子共价连接和分散后,可以得到更高的荧光量子产率,再经柱色谱分离后,量子产率可高达60%-70%。C-Dots在多篇报道中实现对多种癌细胞系的成功标记,标记后可利用激光共聚焦显微镜和双光子激发的模式来观察C-Dots在细胞内的分布,本研究检测了C-Dots在癌细胞、干细胞中的标记,发现高两字产率的C-Dots在癌细胞内的标记效率较高,荧光共聚焦显微镜和双光子显微镜标记的结果均显示C-Dots主要分布在细胞质中,并未进入细胞核内。而C-Dots对大鼠骨髓干细胞的标记效率较低,但也主要分布在细胞质中,无法进入细胞核。改研究表明,C-Dots对不同细胞的标记存在差异,纳米荧光材料对干细胞的标记存在一定难度,有待进一步的研究。(本文来源于《全国环境纳米技术及生物效应学术研讨会摘要集》期刊2016-04-08）
杨颖,殷爱红,武文琦,赵春娟,赵君朋[6]（2015）在《基于EnVision多标记读板仪的细胞内钙信号检测技术的研究》一文中研究指出目的研究使用En Vision多标记读板仪检测细胞内钙信号的可行性。方法分别用卡巴胆碱和凝血酶刺激LN229、SKN-MC细胞或者磷脂酶C抑制剂U73122预处理的LN229细胞,使用En Vision多标记读板仪检测细胞内钙信号强度的变化。结果卡巴胆碱诱导的LN229细胞内钙信号变化呈现浓度依赖性;卡巴胆碱和凝血酶诱导的细胞内钙信号变化趋势不同;凝血酶诱导的钙信号变化具有细胞特异性;U73122对凝血酶诱导的钙信号的抑制作用呈现剂量依赖性。结论 En Vision多标记读板仪作为细胞内钙信号检测仪器,具有快速、可重复性好和灵敏度高等优势,适用于钙信号相关的研究和小分子抑制剂的筛选等领域的工作。(本文来源于《山西医科大学学报》期刊2015年06期）
郑林玲[7]（2014）在《量子点标记的呼吸道合胞病毒活细胞内动态输运途径示踪分析》一文中研究指出病毒性疾病,尤其是传染性病毒疾病,严重危害着人类的生命安全及社会活动的有序进行。了解病毒对宿主细胞的侵染机制与致病机理,有利于病毒防治药物的开发,从而从源头上阻断病毒疾病的发生。单病毒示踪技术着眼于探索单个病毒颗粒与宿主细胞之间复杂的动态相互作用,可以实现对病毒侵染过程的每个关键步骤进行实时示踪,为成功揭示病毒侵染机理提供了条件。然而,传统的利用荧光染料和荧光蛋白标记病毒的方法存在着荧光强度低、抗光漂白性差等缺点,难以实现单病毒的长时间可视。而利用量子点这种具有优异发光特性的无机荧光纳米材料标记病毒,可以实现对单个病毒侵染宿主路径和行为的长时间示踪,有利于深入了解病毒侵染机制。本文即以一种典型的囊膜病毒,呼吸道合胞病毒(RSV)为研究对象,针对病毒侵染过程中的关键事件,首先建立了一系列量子点标记病毒的方法,然后将其用于活细胞内病毒输运途径的实时分析中。主要研究内容包括以下两个方面：1.呼吸道合胞病毒的高效量子点标记(1)利用病毒在组氨酸标签修饰的细胞内的自组装过程原位标记呼吸道合胞病毒。标记策略的基础是呼吸道合胞病毒在宿主细胞膜上装配和释放时细胞表面会表达大量病毒的膜蛋白。利用EDC/NHS对含组氨酸标签(His-tag)的多肽羧基端进行活化后,可使其与处于细胞表面的病毒膜蛋白上的氨基共价结合,实现对病毒膜蛋白的His-tag标记,当病毒从此细胞出芽后即可带上His-tag。次氮基叁乙酸-Ni (NTA-Ni)修饰的QDs可通过Ni与组氨酸标签的螯合作用与该病毒结合,从而实现对病毒的量子点标记。对病毒免疫荧光与量子点荧光成像的共定位分析显示有71.5±4.1%的病毒能被量子点标记上,说明该方法具有较高的标记效率。并且我们发现利用此原位标记方法获得的QDs标记病毒,比直接对活病毒修饰His-tag及偶联QDs获得的标记病毒感染力高455倍左右,说明此原位标记方法有利于获得高感染力的标记病毒。(2)利用生物素化的宿主细胞膜蛋白及核酸染料对病毒进行原位双标记,以监测病毒进入宿主的早期事件。根据囊膜病毒出芽时一些宿主细胞膜蛋白会掺入成熟的病毒体中的特点,我们提出了一种利用宿主的膜蛋白对呼吸道合胞病毒进行标记的策略。首先通过直接将细胞与生物素化试剂孵育来使细胞膜蛋白被修饰上生物素分子。然后让病毒感染该生物素化的细胞,并在其中增殖,当成熟的病毒在宿主中组装并最终在细胞膜表面释放时,生物素化的宿主膜蛋白可以自然地嵌入病毒囊膜中。此外,在病毒扩增过程中外加可绑定RNA的核酸染料可以使病毒的RNA也可以同时被标记上,实现对病毒内外组分的原位同时标记。由于病毒表面的生物素分子与链霉亲和素修饰的量子点能高效率的结合,使病毒的量子点标记效率可以达到83.7±4.6%。同时由于生物素修饰的是细胞膜蛋白,避免了对病毒表面活性位点的占据,使得量子点标记后的病毒仍可以保持95.4%的感染力。最后,通过荧光成像实时监测量子点与核酸染料双色标记的单个病毒对细胞侵染的早期行为,我们对病毒进入细胞的动力学过程及核酸在靠近细胞膜区域的快速释放过程进行了分析。(3)基于病毒自组装过程的双色量子点标记病毒。由于量子点具有较宽的激发光谱和窄而对称的荧光发射峰,同时使用不同发射的量子点不会产生光谱重迭,因此非常适合用于多色标记成像。而已建立的量子点标记病毒的方法均只使用了单色量子点。为了更好地对病毒内外组分进行长时间成像示踪,我们设计了一个对病毒囊膜蛋白和核酸同时进行量子点标记的方法。对病毒核酸的标记基于一个红色量子点-分子信标基因探针,它可以与病毒基因组中的一段重复序列杂交,由于信标一端带有猝灭基团,使其成为一个由病毒基因组触发的荧光开关。我们在病毒复制过程中通过膜通透试剂将该基因探针引入被感染细胞的细胞质,使其与病毒基因组中对应序列进行杂交,实现对病毒基因组的荧光标记。对病毒膜蛋白的标记是通过将病毒表面糖蛋白生物素化,再连接链霉亲和素偶联的绿色荧光量子点。两个标记步骤均是利用了病毒在宿主细胞内的自组装过程,并在其大量复制准备出胞时进行的。与其他病毒标记方法相比,我们这种标记策略温和、对病毒感染力影响较小,并且可以适用于所有从细胞质膜出芽的囊膜病毒的标记。2.实时示踪量子点标记的呼吸道合胞病毒在活细胞内的动态输运途径我们通过对量子点标记病毒的长时间荧光监测,及其与细胞内多种蛋白和细胞器的荧光共定位分析,并结合药物抑制实验,仔细研究了呼吸道合胞病毒对宿主细胞侵染过程。研究结果显示该病毒的内在化是一个快速而高效的过程,且主要包含叁个关键事件：1)发动蛋白和小窝蛋白／脂筏介导的病毒内在化；2)微丝依赖的病毒运输过程；3)微管依赖的病毒快速运输过程及其在内质网的积累。此外,该研究结果同时也表明,我们的量子点标记策略不仅不会影响病毒的内在化途径,还有助于直观地研究病毒侵染过程。综上所述,本文利用囊膜病毒在宿主细胞中的增殖和自组装过程,建立了对于病毒内外组分的量子点标记方法,并将其用于对病毒侵染宿主过程的实时示踪分析。本文提出的原位标记策略避免了对活病毒的直接操作,大大降低了量子点标记对病毒感染力的影响,并且实现了对病毒囊膜和核酸的双色量子点标记,有望对纳米材料标记成像策略提供新思路,并拓展无机荧光纳米材料在生物成像领域的应用。(本文来源于《西南大学》期刊2014-10-14）
曾苗雨[8]（2014）在《超顺磁氧化铁标记对大鼠脂肪干细胞内IRPs/IREs结合活力与铁含量的关联研究》一文中研究指出研究背景随着基础实验医学的发展,干细胞移植技术也经历着日新月异的变化；其在人体多种疾病的治疗,比如堵塞血管的再通,受损组织的修复,以及糖尿病的移植治疗等等方面,前景十分的诱人。因此,近年来,干细胞研究愈发成为实验医学界的研究热点。目前,在临床应用中,主要有以下两种干细胞的应用性较好：1、骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchyme Stem Cells, BMSCs);2、胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)。但是,其两者,在具备一定的临床应用价值的同时,都具有较显着的局限性：1、骨髓间充质干细胞具有来源比较不足、提取相对困难的缺点；2、胚胎干细胞由于是一种来源于异体的干细胞,其不可避免的具有免疫排斥反应；而且,胚胎干细胞在使用过程中,还不可避免地涉及到伦理学等种种问题。所以,急需找到一种来源充分、取材方便、且患者容易接受的干细胞来源,以使干细胞移植在临床应用方面,取得长足的进展与突破。在2001年,Zuk等人研究宣布,从人体抽脂术所提取的脂肪组织悬液中,经过一定的不太繁杂的实验步骤,能够成功地分离提取出一种细胞：这种细胞具有干细胞的生物学特性,当时称之为脂肪间充质干细胞(Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells, ADMSCs).如今简称其为脂肪干细胞(Adipose Tissue-Derived Stem Cells, ADSCs)。脂肪干细胞的发现,打开了干细胞移植研究的一扇新窗户,为临床应用的干细胞来源提供了新的选择与希望。干细胞移植入受试者体内后,及时和准确地了解细胞在受试者体内的迁徙、归巢、增殖以及分化等情况,非常有助于评估移植治疗的效果、对移植方法的优化以及对移植窗口期行更合适的选择。近年来,国内、外众多研究者使用超顺磁氧化铁(Supraparamagnetic Iron Oxide, SPIO)对移植的干细胞进行体外标记；超顺磁氧化铁实为一种磁共振阴性对比剂,经其标记后,能够借助磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)在体、无创、动态、实时地对移植细胞进行活体示踪成像,根据靶组织与器官内部的磁共振信号改变,可以判断移植干细胞在体内的迁徙、归巢以及增殖等情况。诚然,SPIO标记干细胞,能够对标记细胞行体外示踪,但是,其对标记细胞最直接的影响就是引起细胞内的铁超载。研究证实,SPIO标记细胞后,细胞体内的铁浓度较未标记时的浓度增加数十倍甚至数百倍。铁,是细胞体内的一种非常重要的微量元素,它是维持细胞的增殖、生长以及机能活动的一种不可或缺的重要物质,它在细胞体内的电子传递、DNA合成以及氧气的运输等过程中,具有着举足轻重的作用。对干细胞行SPIO铁标记后,细胞内铁含量的时间-浓度关系,即铁标记后,细胞内的铁含量随时间的变化关系,未有研究明确涉及,有必要阐明此两者关系。干细胞移植治疗的主要目的,是将干细胞移植到特定的靶器官或组织内,使用相应的技术手段,使其按照预想地程序分化成特定的组织细胞,执行特定器官或组织的相应功能。所以,要求SPIO在细胞内的停留应该能够持续足够的时间,让使用MRI对干细胞行示踪观察时,MRI能够准确、全面地判断移植干细胞在体内的各种情况,并对移植疗效进行精确评估。有研究证实,SPIO标记干细胞后,MRI对其行示踪观察的有效时间可长达21天。所以,有必要阐明SPIO标记干细胞后,细胞内铁含量,能否被MRI作定性、定量分析,这也是对移植细胞在体示踪的关键。铁调节蛋白／铁反应元件系统(Iron Regulatory Proteins/Iron Responsive Elements System, IRPs/IREs系统)是细胞体内一种非常重要的调节系统,它能够维持细胞体内的铁稳态。IRPs/IREs系统包括：铁蛋白(Ferritin、转铁蛋白受体(Transferrin Receptor, TfR)以及铁调节蛋白(Iron Regulatory Proteins, IRPs),叁者相互作用,共同维持细胞内的铁稳态；其中Fn和TfR的表达,均受到IRPs在转录后水平上的调控。IRPs则通过与TfR和Fn mRNA上的高度保守的非翻译区(Untranslated Region, UTR)作用,以实现调控细胞内铁稳态的功能。TfR和FnmRNA的UTR与IRPs相结合的位点被称为铁反应元件(Iron Response Elements, IREs)。IRPs/IREs对细胞内铁的基本调控机理如下：当细胞内铁超载时,(1)IRPs与TfR mRNA3'端UTR的IREs(TfR有5个IRE)结合活力下降或者不结合,导致TfR mRNA的不稳定,更易受到核酸酶的攻击从而发生降解,从而导致转铁蛋白受体翻译水平的下降,细胞摄取铁的减少。(2) IRPs与Fn mRNA5'端UTR的IRE(Fn有一个IRE)结合活力下降或者不结合,导致Fn mRNA的翻译增加,则铁蛋白的含量增多,从而螯合细胞质中的游离铁,细胞内过多的游离铁被转化为铁蛋白从而被封闭起来,得以维持了细胞内的铁稳态,降低了游离铁对细胞的毒性作用；相反的,如果细胞内的铁浓度过低时,则执行相反的调控程序。那么,SPIO标记干细胞致细胞内铁超载数十倍甚至百倍,细胞内铁浓度的急剧升高,细胞内IRPs/IREs系统中的各个蛋白的蛋白表达情况呈现出怎么样的动态变化?铁超载后,对IRPs与IREs的结合活力存在何种影响,即细胞内铁浓度与IRPs与IREs的结合活力是否存在着“剂量--效应”关系?目前亦未见研究报道。本研究使用转染剂左旋多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine, PLL)介导SPIO标记大鼠ADSCs,运用电感耦合等离子体质谱仪Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS)及MRI定量检测标记后干细胞不同时间点的铁含量,并初步探讨SPIO标记对干细胞IRPs与IREs的结合活力的影响。研究目的1.探讨PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs后,对干细胞内铁浓度的影响。2.初步探讨PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs后,MRI扫描检测标记干细胞的可行性。3.探讨PLL介导SPIO标记大鼠ADSCs后,对干细胞体内的转铁蛋白受体和铁蛋白的蛋白表达水平的影响,以及细胞内铁超载对IRPs与IREs的结合活力的影响。材料与方法1.大鼠ADSCs的分离、培养以及传代取3周至4周龄、雄性SD大鼠,无菌条件下切开腹股沟区皮肤,切取皮下脂肪组织,冷PBS洗涤3至4遍后,剪成颗粒状,并用0.25%Ⅱ型胶原酶消化30-45分钟,离心(1500rpm,10min),弃上清液,用全培养液(含10%胎牛血清的低糖DMEM)重悬、接种,培养条件如下：饱和湿度、37℃、5%C02的标准环境。24小时后,原代培养细胞行第一次换液,以后每3天换液,贴壁细胞铺满瓶底的70%-80%时,进行传代培养。2.大鼠ADSCs的鉴定(干细胞表面抗原的检测)传至P4代的大鼠脂肪干细胞,吸去细胞培养液；加入5ml PBS洗去残留培养基,弃去PBS(重复二次)；加入1.5ml0.25%胰酶,在显微镜下观察细胞消化情况,在大部分细胞开始变小时,弃去胰酶,加入5ml PBS吹打,吸出PBS,置于离心管中,再加入1ml PBS吹打,吸出PBS,置于离心管中,1000rpm离心5min;弃去PBS,加入600ul PBS,吹打,使细胞均匀悬浮,平均分成6管,其中1管做为空白对照；每管分别加入5ul荧光素标记的抗体(CD29、CD31、 CD44、CD45),37℃下避光孵育30min离心(1000rpm,5min),弃上清；加入1ml PBS,将细胞吹打均匀,1000rpm离心5min,弃上清(重复二次)；每管加入200ul PBS;上机检测。3. SPIO标记大鼠ADSCs,电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测细胞内铁含量本实验使用的SPIO试剂(原始浓度为28mg/ml)。SPIO和PLL加入无血清低糖培养基中,室温下,置于摇床摇晃30分钟混匀,待P2代有贴壁干细胞且铺满瓶底近80%-90%的培养瓶时,加入上述含SPIO及PLL培养基,再加入胎牛血清(终浓度10%)(SPIO终浓度为50μg/mL, SPIO/PLL为1：0.03),在标准环境下(饱和湿度、37-C、5%C02)培养。未标记细胞及共培养12小时以内细胞(时间点分别为：0、2、4、8、12小时),在相应时间点,取标记干细胞,弃培养液,用PBS洗涤3次以去除残余SPIO标记液,用0.25%胰酶消化细胞,加入血清终止消化,离心(1200rpm,3分钟)。弃除上清液,用PBS重悬细胞,计数板行细胞计数,调整至1×106个/ml。取1mL细胞悬液于15mL离心管,2%硝酸溶液6mL充分消化溶解。电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)定量分析铁含量。测量时间点为超过12小时的细胞(16小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天),在共培养12小时后弃含SPIO培养液,冷PBS洗涤叁次以去除残余SPIO及胎牛血清,加入10%全培养液继续培养,符合传代标准时可传代,在相应时间点按照上述步骤操作。ICP-MS测量标记细胞内铁含量。4. SPIO标记大鼠ADSCs, MRI检测细胞内铁浓度4.1磁共振扫描参数磁共振扫描采用3.0T GE超导型磁共振扫描仪,头颅线圈。受检EP管装入自制容器内(灌满10%硫酸铜溶液)。行T2*WI扫描,并获取R2*mapping图。快速梯度回波T2加权像(FAST GRE T2*WI):行冠状位扫描,TR200ms, TE2.2ms,翻转角Flip angle60°,层厚2mm,层间距0mm,矩阵256×256,NEX10次信号采集。FOV15cm。4.2标准浓度-磁共振扫描配制Fe标准浓度的SPIO溶液：50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、25ug/ml、20ug/ml、15ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1ug/ml.以上浓度溶液各取1ml,分装于2ml容量的EP管内。将各标准浓度SPIO溶液的EP管放入自制容器内,灌满硫酸铜溶液(10mmol/l),行MRI扫描,获取T2*值及R2*值。R2*值与浓度拟合直线,获得直线回归方程。4.3SPIO标记细胞-磁共振扫描在有贴壁干细胞(P2代)且铺满瓶底约90%的培养瓶内,加入含SPIO的标记液10ml,在标准环境下培养(饱和湿度、37℃C、5%C02)。共培养12小时以内细胞(时间点分别为：2、4、8、12小时),在相应时间点,取标记干细胞：弃除培养液,用冷PBS洗涤3次以去除残余SPIO标记液,用0.25%胰酶消化细胞,加入血清终止消化,离心(1200rpm,3分钟)。弃除上清液,用冷PBS重悬细胞,计数板行细胞计数,调整至2×106个细胞/nl。取0.5ml细胞悬液,加入0.5m1的8%的明胶溶液,充分混匀,稍待片刻,等气泡升起,然后放入冰块中让其冷却、凝固。最终浓度为1×106个细胞/ml。测量时间点为超过12小时的细胞(16小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天),在共培养12小时后弃SPIO标记液,冷PBS洗涤叁次以去除残余SPIO,加入10%全陪养液继续培养,符合传代标准时予以传代,在相应时间点按照上述步骤操作。将SPIO标记后不同时间点提取细胞的EP管放入特制容器内,灌满硫酸铜溶液(10mmol/l)。行MRI扫描。获取T2*值及R2*值,R2*值代入上述直线回归方程,得出相应浓度值。5Western-Blot检测PLL介导SPIO标记后干细胞内转铁蛋白受体、铁蛋白轻链及铁蛋白重链的蛋白表达的影响。本实验采用经转染剂PLL介导SPIO标记的大鼠ADSCs细胞,分别在标记前(0小时)、标记后1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天用裂解液和蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白,并用BCA法测定不同时间点的蛋白浓度,进行Western Blot实验,其步骤大致如下：5.1电泳5.2电转5.3对PVDF膜的免疫球蛋白结合位点行封闭5.4洗膜,孵育一抗,洗膜,孵育二抗,洗膜叁次5.5ECL显示,并用胶片曝光。将所得结果用扫描仪扫描,应用FluorChem8900软件进行扫描灰度,定量分析上述不同时间点转铁蛋白受体、铁蛋白重链以及铁蛋白轻链的蛋白表达结果。6SPIO标记大鼠ADSCs, RNA结合蛋白免疫共沉淀技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RIP)检测IREs/IRPs结合活力SPIO标记大鼠ADSCs,在相应时间点(标记前、标记后1天、2天、4天、7天、14天、21天和28天),按照下述RIP实验,其步骤大致如下：6.1使用抗体来捕获细胞质中的内源性RNA结合蛋白6.2阻止非特异性RNA的结合6.3通过免疫沉淀一并把RNA结合蛋白及其结合的RNA分离出来6.4结合的RNA序列的鉴定：通过Microarray (RIP-Chip),定量RT-PCR方法7统计学方法所有统计计算用SPSS20.0统计分析系统进行,假设检验统一用双侧检验,给出检验统计量及其对应的P值。检验水准为0.05,即P<0.05认为差异有统计学意义。本实验所有数据均为计量资料,采用均数士标准差描述。7.1ICP-MS测量不同时间点的干细胞内铁浓度的比较采用单组的重复测量方差分析,不同时间点间两两的比较采用基于单组重复测量方差分析的LSD检验。7.2MRI测量：铁离子浓度与R2*值采用直线回归进行分析。MRI测量的细胞内铁浓度的预测值与ICP-MS测量的真实值之间的比较,采用配对t检验。7.3比较大鼠ADSCs标记前与标记后不同时间点的Fn-H、Fn-L及TfR的蛋白表达水平,以及IRPs与IREs的结合活力水平,不同时间的比较采用单组的重复测量方差分析,不同时间点间两两的比较采用基于单组重复测量方差分析的LSD检验。结果1.大鼠腹股沟区的脂肪组织在使用0.25%Ⅱ型胶原酶消化后,经过多次的换液、传代,能够在体外成功地分离、培养出大鼠ADSCs。原代细胞培养24小时后即可看到细胞贴壁,细胞呈多种形态,之后经过多次的换液、传代,细胞数量明显增加,形态呈典型的长梭形(成纤维细胞样)外观,此时,细胞形态均一、排列呈漩涡状(有一定方向性)。在原代细胞培养到6-7天时,需进行第一次传代,之后约3-4天可传代一次。2.从SD大鼠腹股沟区脂肪垫中分离提取的细胞,经流式细胞仪检测对其P4代细胞行检测,发现96.5%的细胞表达CD44,98.4%的细胞表达CD29,而只有8.4%的细胞表达CD31, CD45的细胞表达则仅有2.5%。结果表明：分离的细胞表型较均一。3. ICP-MS检测SPIO标记大鼠ADSCs细胞内铁含量：未标记组细胞,铁浓度0.393±0.027pg/cell。SPIO标记后2小时测量,细胞内铁含量即可见增高,铁浓度2.627±0.207pg/cell,之后继续逐渐升高,在标记后第2天,铁离子浓度的均值达到最大值,35.315±2.041pg/cell,之后逐渐降低,第28天为1.350±0.260pg/cell,28天细胞内铁浓度仍未恢复标记前水平(P<0.05)。经单组重复测量方差分析,不同时间的铁浓度有显着性差异(F=761.129,P<0.001)。基于单组重复测量方差分析的多重比较(LSD)方法进行分析,发现2h与3w,8h与12h,4d与1w差异无统计学意义(P>0.05),其他各组间的比较差异均有统计学意义(P<0.05)。4MRI定量分析干细胞SPIO标记后细胞内铁含量4.1MRI扫描标准浓度铁溶液标准浓度铁溶液进行MRI扫描,测量得出T2*值,并转换成R2*值。铁浓度作为应变量,R2*值作为自变量,对铁浓度(Y)与R2*值(X)进行直线回归分析,最后的拟合的直线回归方程为：y=-5.672+0.296x,模型检验结果为,模型有统计学意义(F=4579.44, P<0.001), R=0.992, R square=0.983,铁浓度和R2*值存在很强的线性关系。经检验,回归方程的R2*值的系数有统计学意义(t=67.672,P<0.001)。4.2SPIO标记细胞的磁共振扫描,计算细胞内铁浓度磁共振扫描SPIO标记不同时间点细胞(与ICP-MS测量的为同一批次细胞,不同的处理方法),测量其T2*值及R2-值。根据SPIO标记细胞R2*值代入直线方程,得到铁离子浓度的预测值。ICP-MS测量的铁浓度与MRI预测的铁浓度两组间没有统计学差异(F=0.291,P=0.598),不同时间点之间存在统计学差异(F=1489.97,P<0.001)。对每个时间点进行配对t检验发现,2天,4天,7天,14天的两组间的比较均无统计学意义(P>0.05),其他时间点间均有统计学差异(P<0.05)。5. SPIO标记对ADSCs Fn-L、Fn-H及TfR蛋白表达的影响我们用Western Blot实验的方法,定量分析了SPIO标记大鼠脂肪干细胞后不同时间段,细胞内IRPs/IREs系统的铁蛋白重链Fn-H、铁蛋白轻链Fn-L及转铁蛋白受体TfR的蛋白表达水平。见表1。5.1Fn-H蛋白表达水平SPIO标记1天后,与标记前比较,Fn-H蛋白水平显着升高(P<0.001),PLL介导SPIO标记大鼠脂肪干细胞可促进Fn-H蛋白的表达,随着时间的推移Fn-H蛋白水平有恢复未标铁的趋势,在标记后28天,并未恢复到未标铁时的水平。5.2Fn-L蛋白表达水平SPIO标记1天后,与标记前比较,Fn-L的蛋白水平显着升高(P<0.05),之后逐渐降低,至SPIO标记后21天,Fn-L蛋白表达恢复至未标铁时的水平(P>0.05)。5.3TfR蛋白表达水平SPIO标记1天后,与标记前比较,TfR的蛋白水平显着降低(P<0.001),之后继续降低,至第4天,达到最低,之后逐渐升高,TfR蛋白表达在第21天,恢复至未标铁时的水平(P>0.05)。6RIP检测SPIO标记干细胞对IRPs与IREs的结合活力我们使用PLL转染剂介导SPIO对大鼠脂肪干细胞进行标记,分别在不同时间点采用RIP方法对细胞内的Fn-L mRNA与IRP1,以及TfR mRNA与IRP1的结合情况进行定量检测。6.1Fn-L mRNA与IRP1结合活力SPIO标记后第2天,Fn-L mRNA上IRP1蛋白的结合水平显着降低(P<0.05),表明IRP1结合Fn-L mRNA的活力显着降低；而随着SPIO标记后时间的推移,Fn-L mRNA上IRP1蛋白的结合水平逐渐回升,到14天时Fn-L mRNA上IRP1蛋白的结合水平与未标铁时的结合水平没有显着差异(P>0.05)。6.2TfR mRNA与IRP1结合活力SPIO标记后第4天、第7天的TfR mRNA上IRP1蛋白的结合水平显着降低(P<0.05),表明IRP1结合TfR mRNA的活力显着降低；而随着SPIO标记后时间的推移,TfR mRNA上IRP1蛋白的结合水平逐渐回升,到14天时TfRmRNA上IRP1蛋白的结合水平与未标铁时的结合水平没有显着差异(P>0.05)。结论大鼠腹股沟区皮下脂肪组织中能够成功提取脂肪间充质干细胞。提取的干细胞具有间充质干细胞的形态学特点,还具有提取、分离、培养简便的优点,且培养的细胞在体外增殖能力强、生物学特征较稳定。运用转染剂PLL介导SPIO共培养方式标记大鼠ADSCs,简便、高效。SPIO标记28天内的干细胞,ICP-MS能够精确检测干细胞内铁含量。MRI能够精确预测细胞内铁含量。MRI预测值与ICP-MS测量值有很高的一致性。SPIO标记后,干细胞内的Fn-L以及TfR的蛋白水平的改变只是短暂的,4周内会逐渐恢复至为标记前水平；而Fn-H则表现出了有恢复标记前水平的趋势。SPIO标记后,干细胞内Fn-L mRNA与IRPl以及TfRmRNA与IRP1的结合活力的改变也是短暂的,也会在2周内逐渐恢复至标记前水平。SPIO标记干细胞后,对其进行示踪,对于干细胞来说,安全、可靠。(本文来源于《南方医科大学》期刊2014-05-12）
张毅,高星杰,付雪,苏超,史雪彬[9]（2014）在《活细胞内人AGTR1-3′UTR的荧光标记及应激定位分析》一文中研究指出利用噬菌体衣壳蛋白MS2和带有序列特异性茎环结构(含有MS2蛋白结合位点)的RNA之间的高度亲和力,对外源性人血管紧张素1型受体(angiotensin II receptor type 1,AGTR1)mRNA 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段进行红色荧光标记,进而在活细胞(HeLa)内研究该mRNA片段的应激生物学行为。通过在pSG5空载体质粒上先后插入两个双链DNA目的片段AGTR1-3′UTR和24×MS2,构建重组质粒pSG5/AGTR1-3′UTR/24×MS2,并将该质粒与重组质粒pERFP/MS2和pEGFP/C1-G3BP共转染入Hela细胞。荧光显微成像结果显示,AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段能够携带具有入核信号的MS2-RFP融合蛋白离开胞核进入胞浆,而且在亚砷酸盐刺激下,红色荧光标记的AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段可在胞浆中形成与应激蛋白G3BP-GFP共定位的颗粒。该结果表明,针对AGTR1-3′UTR片段的MS2-RFP荧光标记系统构建成功,该荧光标记系统能有效避免假阳性的荧光信号。在细胞受到氧化应激时,AGTR1-3′UTR会被招募至胞浆中的应激颗粒结构中,启示了AGTR1-3′UTR区域对于调控AGTR1 mRNA在细胞内的应激定位具有重要作用。(本文来源于《中国细胞生物学学报》期刊2014年05期）
李发慧,王芳,王江云[10]（2014）在《活细胞内RNA标记和成像技术》一文中研究指出RNA根据其定位、结构、修饰以及与其他生物分子的动态相互作用,复杂而精确地执行丰富多彩的功能。RNA-蛋白质相互作用和RNA在细胞内定位的异常与多种疾病的发生发展密切相关。活细胞RNA标记和成像技术已成为研究RNA定位和运动、基因转录调控及RNA-蛋白质相互作用等生物学过程的有力工具。活细胞RNA标记和成像技术的开发已成为国际科学研究领域的热点。将目前存在的活细胞内RNA标记和成像技术方面的研究进展进行概述。(本文来源于《生命科学》期刊2014年03期）
细胞内标记论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的生物学功能及作用机制,并为研究细胞器相互作用提供基础.但由于无膜细胞器或膜接触位点很难分离纯化,传统的生化方法难以系统解析其中的蛋白质组.最近报道的几种基于酶类的蛋白质邻近标记技术,则为系统分析上述空间受限的蛋白质组这一难题提供了有效的解决方案.通过将能催化产生活性自由基(最常见的是生物素及其衍生物的自由基)的酶连接到目标蛋白上,可对其邻近的蛋白质组进行共价标记,从而使后者的分离和鉴定成为可能,并可以运用于活细胞中的动态标记.我们在此综述了几种最新的邻近标记策略的原理及应用,并对它们的优势与局限性进行了比较,以期为细胞器互作的蛋白质组学研究提供参考.
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
细胞内标记论文参考文献
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