稻瘟病抗性基因Pi63启动子的功能分析

论文摘要

稻瘟病是水稻最严重的病害之一,在世界范围内引起水稻大量减产。挖掘新的抗性基因,培育新型抗病品种是防治稻瘟病的最环保且有效的方法。研究水稻抗病分子机制是水稻抗性育种进行遗传改良的重要基础。Pi63是水稻4号染色体上克隆的抗性基因,田间试验表现为广谱抗性。已有研究结果表明,Pi63的抗性与其表达水平呈正相关。启动子是控制基因表达的重要组件,对抗性基因启动子的表达特性进行研究是阐明抗病分子作用机制的重要途径,本研究对稻瘟病抗性基因Pi63的启动子进行了表达分析,取得研究结果如下:（1）对pPi63:GUS转基因植株进行了分子鉴定及拷贝数鉴定,并对单拷贝植株的不同组织进行了GUS染色。染色结果显示,Pi63启动子驱动的GUS在叶和叶鞘中表达水平较高,在枝梗和护颖中表达水平较低,在茎、根和成熟的种子内没有表达。上述结果表明:Pi63启动子具有一定组织特异性。（2）对T1代及T2代Pi63转基因植株进行了分子鉴定及拷贝数鉴定,选取单拷贝植株进行稻瘟病菌活体接种实验,通过qPCR对接种前后Pi63及防御相关基因的表达量变化进行了分析。结果显示,Pi63的表达受稻瘟病菌诱导上调,并在诱导后36 h达到峰值,在36-48 h间迅速下调,随即再次上调。上述结果表明:Pi63启动子是一个对稻瘟病菌侵染迅速产生应答的诱导型启动子。（3）对pPi63:GUS转基因单拷贝植株进行了激素诱导表达后的GUS染色,染色结果显示,在外源SA处理条件下,Pi63启动子驱动的GUS表达显著上调,外源MeJA处理后,Pi63启动子驱动的GUS表达明显下调,6-BA、ACC和NAA处理前后,GUS表达无明显变化。上述结果表明:Pi63主要参与了SA和JA介导的抗病途径。（4）对T1代pPi63-P0、P1、P2、P3:GUS转基因单拷贝植株叶片进行GUS染色,染色结果显示,所有叶片均可染色,不同缺失体染色程度不同,其中P1最深,P0次之,P2和P3染色程度较浅。上述结果表明:Pi63启动子-1367-2148bp间存在正调控元件,推测与茉莉酸响应元件相关,-2148-2896bp间存在负调控元件,推测与生长素响应元件相关,从而调节了抗性与产量间的平衡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 水稻稻瘟病概述
•   1.2 水稻稻瘟病抗性基因研究进展
•   1.3 植物的防御反应
•   1.4 植物免疫系统中的信号分子
•   1.5 植物启动子相关研究
•     1.5.1 组成型启动子
•     1.5.2 组织特异型启动子
•     1.5.3 诱导型启动子
•   1.6 研究目的及内容
• 第二章 Pi63 转基因植株的分子鉴定与抗性分析
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 水稻品种和稻瘟病菌菌株
•     2.2.2 主要试剂及配方
•     2.2.3 主要培养基
•     2.2.4 引物序列
•     2.2.5 主要仪器设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 水稻材料的准备
•       2.3.1.1 无菌发苗
•       2.3.1.2 Pi63 转基因幼苗的分子鉴定
•       2.3.1.3 Pi63 转基因幼苗的拷贝数鉴定
•     2.3.2 活体接种稻瘟病菌
•     2.3.3 qPCR分析Pi63 转基因植株在抗病中的作用
•       2.3.3.1 接种前后的水稻叶片总RNA的提取
•       2.3.3.2 cDNA的合成
•       2.3.3.3 接种前后Pi63 和防御相关基因的表达量分析
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 Pi63 转基因幼苗分子鉴定结果
•       2.4.1.1 Pi63 转基因幼苗阳性鉴定结果
•       2.4.1.2 Pi63 转基因幼苗拷贝数鉴定结果
•     2.4.2 稻瘟病菌接种与抗性鉴定
•     2.4.3 接种前后Pi63 的表达量分析
•     2.4.4 接种稻瘟病菌前后相关防御基因的表达量检测
•     2.4.5 Pi63 转基因植株农艺性状检测
•   2.5 讨论
• 第三章 水稻Pi63 基因启动子的表达分析
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 水稻材料的准备
•       3.3.1.1 无菌发苗
•       3.3.1.2 Pi63 转基因幼苗的分子鉴定
•       3.3.1.3 Pi63 转基因幼苗的拷贝数鉴定
•     3.3.2 pPi63:GUS单拷贝材料不同组织的GUS染色
•     3.3.3 不同激素诱导Pi63 启动子表达
•       3.3.3.1 不同激素离体诱导Pi63 启动子表达
•       3.3.3.2 不同激素活体诱导Pi63 启动子表达
•     3.3.4 农杆菌介导的遗传转化
• 0代pPi63-P2:GUS转基因植株分子鉴定'>    3.3.5 T₀代pPi63-P2:GUS转基因植株分子鉴定
• 0代pPi63-P2:GUS转基因植株DNA提取'>      3.3.5.1 T₀代pPi63-P2:GUS转基因植株DNA提取
• 0代pPi63-P2:GUS转基因植株阳性鉴定'>      3.3.5.2 T₀代pPi63-P2:GUS转基因植株阳性鉴定
•     3.3.6 启动子分区段缺失体转基因材料幼苗准备
•       3.3.6.1 无菌发苗
•       3.3.6.2 启动子分区段缺失体转基因材料分子鉴定
•       3.3.6.3 启动子分区段缺失体转基因材料拷贝数鉴定
•       3.3.6.4 启动子分区段缺失体转基因材料GUS染色
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 pPi63:GUS转基因材料分子鉴定结果
•       3.4.1.1 pPi63:GUS转基因材料阳性鉴定结果
•       3.4.1.2 pPi63:GUS转基因材料拷贝数鉴定结果
•     3.4.2 pPi63:GUS转基因植株的组织化学染色分析
•     3.4.3 不同激素处理pPi63:GUS材料离体叶片后GUS染色结果
•     3.4.4 激素活体喷雾处理pPi63:GUS材料前后GUS染色结果
•     3.4.5 pPi63-P2:GUS遗传转化及阳性鉴定结果
•     3.4.6 启动子分区段缺失体转基因材料阳性鉴定结果
•     3.4.7 启动子分区段缺失体转基因材料拷贝数鉴定结果
•     3.4.8 启动子分区段缺失体GUS染色结果
•   3.5 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文
• 参与的科研课题
• 参与的学术会议

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑洁

导师: 徐鑫

关键词: 拷贝数鉴定,抗病性分析,表达量分析,染色

来源: 中南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,植物保护

单位: 中南民族大学

基金: 湖北省自然科学基金资助项目(2018CFB476),中央高校专项基金资助项目(CZY18043),湖北重点实验室建设基金(2018BFC360)

分类号: Q943.2;S435.111.41

总页数: 55

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