鸡源呼肠孤病毒检测方法的建立及其σC蛋白单克隆抗体的制备

论文摘要

禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）属于呼肠孤病毒科（Reovirdae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）,主要引起肉鸡的病毒性关节炎和腱鞘炎。近年来,我国山东、江苏、河北、福建、浙江等地的肉种鸡场和商品肉鸡场先后发生该病疫情的报道,给肉鸡养殖业带来了严重损失。本研究针对ARV野毒株LY383建立了地高辛标记的核酸探针检测方法,同时对其主要抗原蛋白σC进行了原核表达,进而建立了ARV抗体的间接ELISA检测方法,并利用纯化的重组蛋白,制备了相应的单克隆抗体,为ARV的临床检测和后续研究提供了技术支持,具体研究内容如下:根据ARV S1基因序列,设计特异性的引物,通过RT-PCR扩增得到229bp的基因片段,将纯化后的胶回收产物利用地高辛进行标记,制备核酸探针,建立地高辛标记的核酸探针检测ARV的方法。特异性试验结果表明,H9亚型禽流感病毒（H9-AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、禽腺病毒（FAV）、新城疫病毒（NDV）的核酸无法与探针杂交显色,只有ARV与该探针杂交结果为阳性;敏感性试验结果表明,标记探针最低检出量为50pg/μL。对临床采集的13份疑似感染病料进行检测,与RT-PCR检测结果的符合率为100%。制备的探针保存在-20°C冰箱中90d后仍可继续用于检测,稳定性较好。以上结果表明所建立的ARV地高辛标记的核酸探针检测方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性,操作简便,可大批量检测临床样本。设计一对特异性引物,经RT-PCR反应扩增出ARVσC基因片段,克隆至pMD18-T载体,将测序鉴定正确的重组载体σC-pMD18-T和表达载体pET-32a（+）分别进行双酶切反应后,构建σC-pET-32a重组表达质粒,转入E.coli BL21（DE3）表达菌。通过优化蛋白诱导表达的条件,表达融合蛋白,经过尿素梯度洗涤法初步纯化和镍柱再次纯化后,进行SDS-PAGE电泳,确定目的蛋白的表达形式为包涵体,Western blot鉴定结果显示,表达的融合蛋白具有良好的反应性。利用表达的重组蛋白建立检测ARV抗体的间接ELISA方法:棋盘稀释法确定目的蛋白的最佳包被稀释度为1:1000;血清最佳稀释度为1:10;最佳封闭液为5%脱脂奶粉;兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗稀释度为1:500。该方法与其他病原体之间无阳性反应,板间和板内试验确定其变异系数为4.85%至7.93%,具有较好的重复性,可应用于大规模血清学调查和流行病学监测。将纯化后的σC重组蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经过筛选和亚克隆最终获得2株能稳定分泌σC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为A1S9、B2D9,通过抗体亚类试剂盒测定所获得的单抗为IgG1亚型、轻链为κ链。ELISA效价测定结果显示,上清效价为1:100,小鼠腹水的效价为1:128000和1:256000。Western blot和IFA鉴定结果显示制备的单抗可与ARV发生特异性反应。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 禽呼肠孤病毒感染的研究现状
•     1.1.1 病原学
•     1.1.2 流行病学
•     1.1.3 致病性
•     1.1.4 防控措施
•   1.2 禽呼肠孤病毒诊断方法的研究进展
•     1.2.1 病毒的分离与鉴定
•     1.2.2 血清学诊断方法
•     1.2.3 分子生物学诊断方法
•   1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 毒株、细胞、载体、血清及实验动物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 主要溶液的配制
•   2.2 方法
•     2.2.1 ARV地高辛核酸探针检测方法的建立
•     2.2.2 ARVσC蛋白的原核表达
•     2.2.3 检测ARV抗体间接ELISA方法的建立
•     2.2.4 ARVσC蛋白单克隆抗体的制备
• 3 结果
•   3.1 ARV核酸探针的制备
•     3.1.1 PCR扩增
•     3.1.2 敏感性试验
•     3.1.3 特异性试验
•     3.1.4 稳定性试验
•     3.1.5 临床样品的初步检测
•   3.2 ARVσC基因的原核表达
•     3.2.1 目的基因的扩增
•     3.2.2 重组表达载体σC-pET32a的双酶切鉴定
•     3.2.3 重组蛋白最佳表达条件的优化
•     3.2.4 重组蛋白的纯化及表达形式的确定
•     3.2.5 Western-blot分析鉴定
•     3.2.6 蛋白浓度的确定
•   3.3 检测ARV抗体的间接ELISA方法建立
•     3.3.1 抗原最佳包被浓度与血清稀释度的确定
•     3.3.2 抗原最佳包被条件的确定
•     3.3.3 最佳封闭液的确定
•     3.3.4 兔抗鸡IgG-HRP酶标抗体最佳稀释度的确定
•     3.3.5 阴阳性临界值的确定
•     3.3.6 特异性试验
•     3.3.7 与商品化试剂盒的比较
•     3.3.8 重复性试验
•     3.3.9 临床样品的检测
•   3.4 ARVσC单克隆抗体的制备与鉴定
•     3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定
•     3.4.2 杂交瘤细胞的筛选
•     3.4.3 单克隆抗体亚类的测定
•     3.4.4 单克隆抗体效价的测定
•     3.4.5 单克隆抗体反应性鉴定
•     3.4.6 间接免疫荧光鉴定
•     3.4.7 稳定性试验
•     3.4.8 腹水纯化
• 4 讨论
•   4.1 核酸探针的制备
•   4.2 ARV σC 蛋白的原核表达
•   4.3 检测 ARV 抗体间接 ELISA 方法的建立
•   4.4 ARV σC 单克隆抗体的制备与鉴定
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘赫

导师: 胡敬东

关键词: 禽呼肠孤病毒,地高辛核酸探针,蛋白,间接,单克隆抗体

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家重点研发计划项目(2018YFD0500106-3),泰山产业领军人才项目(LJNY201610),山东省农业重大应用技术创新项目(39703)

分类号: S852.65

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