L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造及其在β-丙氨酸生产中的应用

论文摘要

β-丙氨酸是自然界中唯一的β型氨基酸,其作为重要的中间体,广泛被应用于医药、食品、化工等领域。与目前运用较多的化学法生产β-丙氨酸工艺相比,生物法工艺条件温和,特异性强,环境污染较少,具有重要的工业应用前景以及研究价值。L-天冬氨酸-α-脱羧酶（L-aspartate-α-decarboxylase,EC4.1.1.11,PanD）能够催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸。但是目前PanD酶活较低,且丙酮酰基依赖型脱羧酶会出现机理性反应失活现象,所以研发高活性和稳定性的新型L-天冬氨酸-α-脱羧酶,是β-丙氨酸工业化生产中的基础。本论文选择昆虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶（TcPanD）基因在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中重组表达。运用蛋白质工程手段对酶基因进行分子改造,以提高其酶活力和催化稳定性。研究结果如下:1、建立包含3500个突变子的TcPanD突变体文库,筛选得到两个催化活力显著提高的突变体16-H5和18-G6,突变位点分别是R98H、K351E、I451V,酶活分别是原始TcPanD酶活的1.61倍和1.43倍。定点饱和突变及分析确定了突变体的最佳氨基酸组合方式,替换的氨基酸分别是R98H和K351S,并将其命名为TcPanD-R38H/K305S。通过对TcPanD进行同源建模,显示突变的氨基酸位置位于表面位置的无规则卷曲处,通过分子对接分析推测远离底物L-天冬氨酸的高酶活突变位点R98可能是通过一定的作用力参与了结构稳定。靠近L-天冬氨酸的突变位点K305可能是通过增强亲水性提高与底物的结合紧密度,从而提高催化活力。2、将TcPanD的原始酶和突变体纯化至电泳纯度,两者纯化蛋白大小均为65kDa。纯化后的突变体比酶活为7.05 U/mg,是原始酶比酶活的2.45倍。对突变体TcPanD-R38H/K305S酶学性质的研究表明:辅酶磷酸吡哆醛的最佳添加量为0.04%（m/v）,最适温度为50°C,最适pH为7.0。在低浓度（1mM）的金属离子环境下,Na+、Ni2+、Co2+、K+、Ca2+对突变体TcPanD-R38H/K305S有激活作用,高浓度（5mM）的金属离子作用下,激活作用减弱,仅剩下Ni2+、Na+对突变体TcPanD-R38H/K305S还有明显的激活作用。测定了突变体TcPanD-R38H/K305S的动力学参数,Km值为1.23 mM,Vmax值为7.05 U·mg-1,酶催化常数Kcat为7.64s-1,酶催化速率Kcat/Km为6.21 s-1·mM-1。TcPanD的Km值为1.35 mM,Vmax值为2.88 U·mg-1,Kcat为3.12 s-1,Kcat/Km为2.31 s-1·mM-1。突变体TcPanD-R38H/K305S表现出更好的底物亲和力以及更高的催化活力。3、以表达突变体TcPanD-R38H/K305S基因的大肠杆菌细胞作为生物催化剂,以L-天冬氨酸为底物,探究了不同催化条件,包括温度、pH、辅酶、金属离子和动力学参数等对β-丙氨酸产量的影响。确定了全细胞催化最适温度为37oC,最适pH为7.0,辅酶磷酸吡哆醛添加量为10μL/mL,底物浓度为50 g/L。在最适催化条件下,β-丙氨酸的产量可达10.89 g/L。最后采用5 L发酵罐诱导培养突变体TcPanD-R38H/K305S,收集的菌体于反应釜中进行全细胞催化反应,反应体系为1L,37 oC、pH 7.0以及搅拌速度600 rpm的反应条件下,267 g的底物L-天冬氨酸通过分批补料的方式加入。经过转化,最后得到β-丙氨酸的量为170.53 g,摩尔转化率为95.45%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 β-丙氨酸的概述
•     1.1.1 β-丙氨酸的结构与性质
•     1.1.2 β-丙氨酸的应用
•     1.1.3 β-丙氨酸的合成
•   1.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的概述
•     1.2.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的催化机理
•     1.2.2 利用L-天冬氨酸-α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究
•   1.3 酶分子改造技术研究概述
•     1.3.1 理性设计
•     1.3.2 非理性设计
•     1.3.3 突变体文库筛选方法
•     1.3.4 半理性设计
•   1.4 课题的研究目的意义与主要研究内容
•     1.4.1 课题研究目的意义
•     1.4.2 课题研究内容
• 第二章 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌株和质粒
•     2.2.2 试剂和材料
•     2.2.3 培养基及相关试剂的配制
•     2.2.4 主要器材
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的获得
•     2.3.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的引物设计及合成
•     2.3.3 易错PCR扩增L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因
•     2.3.4 PCR产物纯化回收
•     2.3.5 载体的双酶切及纯化
•     2.3.6 L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因与载体连接
•     2.3.7 E.coli BL21（DE3）感受态的准备及转化
•     2.3.8 阳性重组质粒的鉴定
•     2.3.9 随机突变文库的筛选
•     2.3.10 突变体L-天冬氨酸-α-脱羧酶的酶活测定方法
•     2.3.11 突变体的定点饱和突变
•     2.3.12 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的同源建模及突变位点分析
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 TcPanD基因的随机突变
•     2.4.2 变体文库的初筛
•     2.4.3 突变文库复筛
•     2.4.4 定点饱和突变
•     2.4.5 突变体的分子对接分析
•   2.5 小结
• 第三章 L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的酶学性质研究
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌株和质粒
•     3.2.2 试剂与材料
•     3.2.3 培养基与缓冲液
•     3.2.4 仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 突变体的表达与纯化
•     3.3.2 蛋白含量测定
•     3.3.3 SDS-PAGE电泳
•     3.3.4 突变体的酶活测定
•     3.3.5 辅酶磷酸吡哆醛（PLP）的添加量对酶的影响
•     3.3.6 酶的最适温度及温度稳定性测定
•     3.3.7 酶的最适pH及 pH稳定性测定
•     3.3.8 不同浓度金属离子对酶活的影响
•     3.3.9 酶的反应动力学参数测定
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 蛋白质浓度标准曲线
•     3.4.2 SDS-PAGE分析
•     3.4.3 酶磷酸吡哆醛（PLP）的添加量对突变体的影响
•     3.4.4 酶的最适温度及温度稳定性
•     3.4.5 酶的最适pH及 pH稳定性
•     3.4.6 不同浓度金属离子对酶活力的影响
•     3.4.7 突变体的动力学参数
•   3.5 小结
• 第四章 L-天冬氨酸-α-脱羧酶重组菌的5 L发酵罐培养及全细胞转化
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 菌株
•     4.2.2 培养基与缓冲溶液
•     4.2.3 主要仪器
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 全细胞生物催化剂的制备
•     4.3.2 转化时间对β-丙氨酸产量的影响
•     4.3.3 转化温度对β-丙氨酸产量的影响
•     4.3.4 缓冲液pH对 β-丙氨酸产量的影响
•     4.3.5 辅酶PLP添加量对β-丙氨酸产量的影响
•     4.3.6 底物浓度对β-丙氨酸产量的影响
•     4.3.7 全细胞转化制备β-丙氨酸
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 转化时间对产β-丙氨酸的影响
•     4.4.2 转化温度对产β-丙氨酸的影响
•     4.4.3 缓冲液pH对产β-丙氨酸的影响
•     4.4.4 辅酶PLP添加量对产β-丙氨酸的影响
•     4.4.5 底物浓度对产β-丙氨酸的影响
•     4.4.6 全细胞转化制备β-丙氨酸
•   4.5 小结
• 第五章 总结和展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
•   1 作者简历
•   2 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 学位论文数据集

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈虹

导师: 汪钊,于欣君

关键词: 丙氨酸,天冬氨酸脱羧酶,定向进化,酶学性质,全细胞催化

来源: 浙江工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江工业大学

分类号: Q55

DOI: 10.27463/d.cnki.gzgyu.2019.000557

总页数: 71

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