两株H5N8亚型禽流感病毒生物学特性分析及其HA1蛋白抗原表位鉴定

论文摘要

禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的一种高度传染性疫病,在全球范围内持续传播。禽类感染AIV后,有的表现为轻微的临床症状,有的表现出呼吸道疾病和产蛋下降,严重的会导致全身性疾病,死亡率可达100%。尤其是高致病性H5亚型禽流感病毒如H5N1,不仅感染禽类,还能跨越种间障碍从受感染的家禽传播给人类,导致严重的公共卫生危机。随着H5亚型禽流感的蔓延,其危害已引起全世界的关注。高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza,HPAI）H5N8病毒于2010年首次在中国家禽中检测到,并于2014年初在韩国和日本的家禽中出现。2014年末,HPAI H5N8病毒已传播到欧洲和北美洲。目前并没有关于人类感染HPAI H5N8病毒的报告。由于HPAI H5N8病毒能在不同地域间迅速传播,并且能够感染多种鸟类,一旦流行将会对禽类养殖业造成严重的经济损失。据此,本研究对2017年分离于青海湖地区的2株H5N8亚型AIV（QH448和QH450）的生物学特性进行分析,一方面,为快速应对可能突发的流感事件提供一定的理论依据;另一方面,为评价不同地区H5N8毒株的毒力、致病性及流行病学等生物学特性奠定一定基础。首先,对2株H5N8亚型禽流感病毒进行遗传演化分析、禽类和哺乳动物的感染性和致病力实验以及豚鼠间接触传播实验。结果显示:两株H5N8亚型AIV均属于HPAIV;且对小鼠具有较强的感染性,高剂量感染可致其死亡;不具有豚鼠间接触传播的能力。此外,利用杂交瘤细胞制备技术获得5株抗QH448 HA1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞,分别命名为1H12B9、2A9D11、7E9G6、8A12D10和9H10F5。Western blot结果表明:5株单克隆抗体均与H5亚型禽流感病毒感染细胞裂解上清反应。中和实验和血凝抑制实验结果表明,5株单克隆抗体均无病毒中和活性。间接免疫荧光实验表明5株单克隆抗体均具有良好的反应活性和特异性。利用原核表达质粒表达一系列重叠的QH448 HA1蛋白截短体对5株单克隆抗体进行表位鉴定。初步确定1H12B9和7E9G6的识别表位位于HA1蛋白330ATGLRNSPLREKRRKR345之间;2A9D11的识别表位位于HA1蛋白310IHPLTIGECPKYVKSN325之间;8A12D10的识别表位位于HA1蛋白271KIVKKGDSTIMKSEV285之间;9H10F5的识别表位位于HA1蛋白121LSRINHFEKILIIPKS136之间。通过比较单克隆抗体识别的抗原表位同源性,发现这些表位在H5HA序列中高度保守。综上所述,本研究成功的对两株H5N8亚型禽流感病毒的生物学特性进行了分析。成功的对5株H5亚型的HA1蛋白单克隆抗体进行了抗体特性分析,并鉴定出了4种保守的抗原表位。AIV的保守蛋白或者蛋白中保守的表位是制备具有交叉保护性疫苗的一个可能的途径。本研究筛选出的保守的线性表位为制备新的疫苗提供了素材。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 流感病毒基因组组成和复制周期
•     1.1.1 流感病毒基因组组成
•     1.1.2 流感病毒复制周期
•   1.2 禽流感病毒的抗原性变异
•     1.2.1 血凝素蛋白（HA）的结构与功能
•     1.2.2 神经氨酸酶蛋白（NA）的结构与功能
•     1.2.3 禽流感病毒变异的分子基础
•   1.3 H5亚型禽流感病毒的流行病学概况
•     1.3.1 H5 亚型禽流感病毒的流行与传播
•     1.3.2 H5N8 亚型禽流感病毒的流行与传播
•   1.4 抗原表位鉴定方法的研究进展
•     1.4.1 肽扫描技术
•     1.4.2 噬菌体展示技术
•     1.4.3 氨基酸定点突变技术
•     1.4.4 生物信息学
•   1.5 研究的目的与意义
• 第二章 两株H5N8亚型禽流感病毒遗传演化与致病性分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 细胞与毒株
•     2.1.2 主要仪器与试剂
•     2.1.3 实验动物及相关措施
•     2.1.4 病毒分离、纯化以及鸡胚半数致死量（EID50）的测定
•     2.1.5 病毒的全基因组序列测定
•     2.1.6 遗传进化分析以及表型分子标志分析
•     2.1.7 病毒体外复制动力学曲线
•   2.2 结果
•     2.2.1 两株病毒遗传演化分析
•     2.2.2 QH448和QH450 病毒的基因组序列同源性分析
•     2.2.3 QH448和QH450 病毒氨基酸位点分析
•     2.2.4 QH448和QH450 病毒复制动力学曲线
•     2.2.5 QH448与QH450 病毒对SPF鸡的致病性
•     2.2.6 QH448与QH450 病毒对BALB/c小鼠的致病性
•     2.2.7 QH448与QH450 病毒豚鼠接触传播实验结果
•   2.3 讨论
• 第三章 单克隆抗体抗原表位鉴定
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 细胞与试剂
•     3.1.2 纯化单克隆抗体
•     3.1.3 纯化的单克隆抗体Western blot验证
•     3.1.4 中和实验和 HI 实验
•     3.1.5 间接免疫荧光实验
•     3.1.6 PCR扩增
•     3.1.7 重组质粒的构建
•     3.1.8 细菌的转化
•     3.1.9 重组质粒蛋白的截短表达和抗原表位的鉴定
•     3.1.10 单克隆抗体识别的表位同源性比较
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 单克隆抗体亚类鉴定
•     3.2.2 单克隆抗体的纯化
•     3.2.3 单克隆抗体特异性鉴定
•     3.2.4 中和活性测定
•     3.2.5 间接免疫荧光鉴定
•     3.2.6 抗原表位鉴定
•     3.2.7 单克隆抗体识别的抗原表位同源性分析
•   3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 汪亮

导师: 朱启运

关键词: 禽流感病毒,生物学特性,抗原表位

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 家畜病病原生物学国家重点实验室

分类号: S852.65

总页数: 59

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