柯萨奇病毒A组6型临床分离株生物学特性分析及其疫苗候选株筛选

论文摘要

柯萨奇病毒 A6（Coxsackievirus A6,CVA6）是手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）的病原体之一,近年来,在中国大陆部分地区CVA6甚至取代EV71和CA16成为HFMD的主要病原体。由CVA6感染引起的HFMD具有与EV71或CA16感染引起的典型HFMD不同的临床特征,CVA6感染也可导致严重的疱疹性咽颊炎、脑膜炎和心肌炎,甚至引起新生儿的死亡,免疫功能正常的成年人感染CVA6后也可患病。同时CVA6病毒在流行季节易与其他型别的肠道病毒混合感染或进行基因重组后形成新型变异毒株,给HFMD的诊断与治疗带来很多困难。为有效减少HFMD的发生,CVA6预防疫苗研发刻不容缓。本研究的临床样本来源于云南省HFMD患儿的咽拭子及粪便,分离并鉴定各样本后对鉴定为CVA6的毒株进行生物学特性分析,根据关键筛选指标进行CVA6疫苗候选株筛选,本研究主要分为以下三个部分。第一部分为CVA6病毒的分离及鉴定。根据病毒核酸VP1段RT-PCR鉴定、血清中和鉴定结果,20份样本中有5份为CVA6单独感染,4份为CVA6与CVA10混合感染,其余为CVA10感染。5个CVA6病毒（57、94、113、129、162）、4份混合样品中的CVA6病毒、CVA6参考株（GS2015-399、GS2015-495）均属于CVA6病毒的 D3 亚型,GS2015-399、57、94、113、129、162、4 份混合样品中的 CVA6病毒均位于云南特有的Yunnan cluster 2分支;VP1段氨基酸序列分析发现存在多个差异位点。7 个 CVA6 病毒（57、94、113、129、162、GS2015-399、GS2015-495）和4份混合样品在RD细胞上的分离率为100%,在Vero细胞中仅有94、129株出现增殖生长。第二部分为CVA6毒株生物学特性分析。病毒生长特性分析、蚀斑形态观察、感染性滴度检测及乳鼠致病性分析等为该部分主要研究内容。5株CVA6病毒中129株在Vero、RD细胞上的感染性滴度最高,增殖速度最快;RD细胞中,5株CVA6病毒的蚀斑形态差异不大,129株在Vero、RD细胞上形成的蚀斑形态不同,94在Vero细胞上不能形成明显空斑;5个CVA6病毒对乳鼠均有致病性,乳鼠经腹腔途径注射病毒后,均于4～6天陆续开始发病,症状严重的乳鼠均出现前后肢麻痹和死亡,相同感染途径和免疫剂量下,129株对乳鼠的致病性更强。第三部分为CVA6疫苗候选株筛选。将毒株是否能在KMB17细胞上增殖生长且具有较高感染性滴度作为首要筛选指标。5株CVA6病毒中仅有129株能在KMB17细胞中增殖生长,其感染性滴度可达7.54lgCCID50/ml,其余4株均不满足首要筛选条件,因此将129株选作后续蚀斑克隆纯化所用毒株;选择第三次蚀斑纯化后感染性滴度最高的1株（8.051gCCID50/ml）作为后续研究的疫苗候选株,命名为129-1克隆株;129-1克隆株经腹腔、肌肉途径攻毒均能使乳鼠产生较明显的肢体麻痹且严重则致死;组织内病毒载量和病理检查结果显示,后肢肌中病毒载量最高,心脏和骨骼肌出现明显病理损伤,肌肉应为病毒的主要复制场所;蚀斑纯化前、后129株均能诱导小鼠产生良好的体液免疫应答,免疫原性较好;甲醛灭活的129-1克隆株经腹腔途径两剂免疫后可诱导小鼠体内产生高效价的中和抗体;128U的该实验性灭活疫苗血清能对106CCID50的CVA6病毒57株提供完全的保护;129-1克隆株在KMB17细胞上传至17代,病毒感染性滴度始终能维持较高的稳定水平。本研究探究了 CVA6临床分离株的生物学特性并根据关键筛选指标最终筛得一株能适应于KMB17细胞且感染性滴度高、免疫原性好的129-1克隆株作为候选疫苗株,用129-1克隆株制备的实验性灭活疫苗可产生高效价的中和抗体,其免疫原性和保护效果较理想。后续仍需对该毒株进行传代培养,并检测各代次病毒的感染性滴度、遗传稳定性、抗原含量等,进而真正建立符合要求的毒种库。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
•   一、HFMD及CVA6流行情况
•   二、CVA6感染的临床症状
•   三、CVA6分子结构及其分型
•   四、CVA6感染机制相关研究进展
•   五、CVA6预防及其疫苗研发现状
•   六、本研究的目的、研究内容及实验方案
• 材料与方法
•   一、实验材料
•     1 病毒样品
•     2 细胞
•     3 实验动物
•     4 使用材料
•     5 相关试剂
•     6 主要溶液配制
•       6.1 细胞、病毒培养液配制
•       6.2 病毒蚀斑实验所用溶液
•     7 主要仪器
•   二、试验方法
•     1 细胞复苏
•     2 细胞传代
•     3 细胞计数
•     4 病毒分离
•       4.1 咽拭子标本处理方法
•       4.2 粪便标本处理方法
•       4.3 病毒分离
•     5 病毒培养
•     6 标准血清制备
•       6.1 CVA10标准血清制备
•       6.2 CVA6标准血清制备
•       6.3 阴性血清
•     7 病毒鉴定
•       7.1 VP1段核酸鉴定
•       7.2 抗体中和试验
•     8 病毒感染性滴度检测及生长特性分析
•     9 病毒蚀斑实验
•       9.1 蚀斑形态观察
•       9.2 蚀斑纯化、扩增及鉴定
•     10 病毒体内致病力检测
•       10.1 CVA6病毒致病性检测
•       10.2 129-1株病毒感染条件探索及临床评分
•       10.3 129-1株病毒感染乳鼠脏器病毒载量检测
•       10.4 129-1株病毒感染乳鼠后组织病理学检查（HE染色）
•     11 免疫原性检测
•       11.1 动物免疫
•       11.2 血清中和抗体效价检测
•     12 实验性灭活疫苗免疫原性评价
•       12.1 129-1株病毒的灭活
•       12.2 灭活性疫苗制备及免疫原性检测
•     13 129-1实验性灭活疫苗免疫保护效果评价
• 结果与分析
•   一、CVA6病毒株分离及鉴定
•     1、病毒鉴定情况
•       1.1 核酸鉴定
•       1.2 抗体中和实验鉴定
•       1.3 种系进化分析
•     2、CVA6病毒分离情况
•   二、CVA6病毒株生物学特性分析
•     1、病毒株生长特性分析
•     2、病毒蚀斑形态分析
•     3、病毒株致病性评价
•   三、CVA6疫苗候选株筛选
• 17细胞上的适应情况'>    1、CVA6病毒株在KMB₁₇细胞上的适应情况
• 17细胞上的生长特性'>    2、129株在KMB₁₇细胞上的生长特性
•     3、蚀斑克隆纯化
•       3.1 蚀斑形态
•       3.2 纯化挑斑
•     4、129-1克隆株病毒致病性分析
•       4.1 临床表现与临床评分
•       4.2 乳鼠生存率
•       4.3 病毒载量
•       4.4 129-1株免疫乳鼠后组织病理学检查
•     5、129株免疫原性评价
•     6、实验性灭活疫苗免疫原性评价
•     7、实验性灭活疫苗免疫保护性评价
• 17细胞上连续传代的感染性滴度变化'>    8、129-1克隆株在KMB₁₇细胞上连续传代的感染性滴度变化
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩略词表（Abbreviation）
• 致谢
• 研究生简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 何鑫

导师: 谢忠平

关键词: 手足口病,柯萨奇病毒组型,生物学特性,疫苗

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 北京协和医学院

分类号: R373.2

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000403

总页数: 59

文件大小: 4898K

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