副结核分枝杆菌MAP3292c丝氨酸蛋白酶的功能研究

论文摘要

副结核病（Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP）引起的反刍动物慢性不可逆的消耗性疾病,以顽固性腹泻、渐进性消瘦和肠黏膜增厚形成皱襞为特征。该病在世界范围内广泛流行,给养牛业和乳品业造成了严重的经济损失。因此,迫切需要深入研究MAP的致病机制,从而为副结核病的疫苗研发及诊断治疗提供有力的科学支持。本研究通过生物信息学预测,MAP中存在一个可能具有编码丝氨酸蛋白酶基因—map3292c,通过PCR扩增、表达载体构建及原核表达纯化获得了MAP3292c蛋白,研究结果表明MAP3292c蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性,通过casein定量的方法,确定了MAP3292c蛋白的最佳作用温度及pH分别为41℃和9.0,证实钙离子能促进MAP3292c蛋白酶活性的发挥。定点突变试验结果表明63H、87D和238S氨基酸残基为MAP3292c的活性中心,特别是238S位点对MAP3292c蛋白酶的活性起着决定性的作用。并且MAP3292c还能通过降解LL-37而破坏其杀菌活性。将map3292c基因连接pMV261穿梭载体,电转入耻垢分枝杆菌后构建重组耻垢分枝杆菌MAP3292c/MS。为了确定MAP3292c蛋白的亚细胞定位,应用差速离心法分别分离MAP3292c/MS和MAP K10参考株的培养上清（CF）、全菌体蛋白（CL）、细胞壁（CW）、细胞浆（CF）和细胞膜（CM）成分,应用抗MAP3292c蛋白的多克隆抗体,以Western Blotting方法确定了MAP3292c蛋白主要定位于细胞壁,并可分泌到培养上清中,少量定位于细胞膜上。为了研究MAP3292c蛋白的致病作用,以重组质粒pMV261-MAP3292c为模板,构建丝氨酸蛋白酶突变体重组菌S238A/MS,将重组菌MAP3292c/MS和S238A/MS分别感染5周龄BALB/c小鼠,以pMV261/MS为对照。结果表明,MAP3292c蛋白酶能够促进耻垢分枝杆菌在小鼠中的定殖能力,并引起小鼠肝、脾和肺不同程度的病理损伤,促进小鼠炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的释放。本研究不仅丰富了MAP的致病机制,也为副结核病的治疗和药物研发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
•   1.1 副结核病概述
•     1.1.1 副结核病的病原学
•     1.1.2 副结核病的流行病学
•     1.1.3 副结核病的防控
•   1.2 MAP的致病机制
•     1.2.1 MAP与巨噬细胞相互作用
•     1.2.2 细胞因子在MAP感染中的作用
•   1.3 丝氨酸蛋白酶概述
•     1.3.1 丝氨酸蛋白酶简介
•     1.3.2 丝氨酸蛋白酶的分类
•     1.3.3 分枝杆菌中的丝氨酸蛋白酶
•   1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 MAP3292c在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体的制备
•   2.1 材料
•     2.1.1 载体、菌株及实验动物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 方法
•     2.2.1 引物设计
•     2.2.2 map3292c基因的扩增
•     2.2.3 map3292c基因重组质粒的构建
•     2.2.4 MAP3292c蛋白的表达
•     2.2.5 MAP3292c 蛋白的亲和层析纯化
•     2.2.6 MAP3292c蛋白的Western Blotting鉴定
•     2.2.7 MAP3292c蛋白的质谱验证
•     2.2.8 MAP3292c自切割蛋白N端测序
•     2.2.9 抗MAP3292c蛋白多克隆抗体的制备
•   2.3 结果
•     2.3.1 map3292c基因的扩增及重组质粒的鉴定
•     2.3.2 MAP3292c蛋白的表达
•     2.3.3 MAP3292c蛋白的亲和层析纯化
•     2.3.4 MAP3292c蛋白的Western Blotting鉴定
•     2.3.5 MAP3292c蛋白的质谱验证
•     2.3.6 MAP3292c蛋白N端测序
•     2.3.7 抗MAP3292c多克隆抗体的制备
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 MAP3292c的蛋白酶活性研究
•   3.1 材料
•     3.1.1 主要试剂
•     3.1.2 主要仪器
•   3.2 方法
•     3.2.1 MAP3292c丝氨酸蛋白酶活测定
•     3.2.2 MAP3292c底物特异性测定
•     3.2.3 二价离子对MAP3292c活性的影响
•     3.2.4 温度和pH对MAP3292c蛋白酶活性的影响
•     3.2.5 MAP3292c蛋白酶活的动力学研究
•     3.2.6 MAP3292c蛋白酶活性位点的确定
•     3.2.7 MAP3292c蛋白切割抗菌肽LL-37 试验
•   3.3 结果
•     3.3.1 MAP3292c丝氨酸蛋白活性测定
•     3.3.2 二价离子对MAP3292c活性的影响
•     3.3.3 温度和pH对MAP3292c活性的影响
•     3.3.4 MAP3292c蛋白酶活性的动力学研究
•     3.3.5 点突变蛋白的纯化
•     3.3.6 点突变蛋白的活性测定
•     3.3.7 MAP3292c蛋白切割抗菌肽LL-37 试验
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 MAP3292c的亚细胞定位及致病性研究
•   4.1 材料
•     4.1.1 菌株载体及实验动物
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•   4.2 方法
•     4.2.1 重组耻垢分枝杆菌的构建与表达
•     4.2.2 重组耻垢分枝杆菌和MAP亚细胞组分分离
•     4.2.3 小鼠感染试验
•     4.2.4 组织病理学分析
•     4.2.5 感染小鼠血清细胞因子的检测
•   4.3 结果
•     4.3.1 MAP3292c/MS的诱导表达
•     4.3.2 MAP3292c的亚细胞定位
•     4.3.3 重组菌MAP3292c/MS和S238A/MS在小鼠脏器中的定殖能力
•     4.3.4 重组菌引起的脏器损伤
•     4.3.5 感染小鼠炎性因子的释放
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘虹秀

导师: 刘思国

关键词: 副结核分枝杆菌,亚细胞定位,致病性

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: “十三五”国家重点研发计划:“牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究”项目,“牛羊常见细菌病的诊断与检测新技术研究”(2016YFD0500905),牛羊重要疫病免疫防控新技术研究,牛羊疫苗新型佐剂及工艺研究项目(2017YFD0500906)项目

分类号: S852.61

总页数: 61

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