猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

论文摘要

为研制特异性敏感性较好的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,更好地实现PRRSV的流行病学监测和诊断,将PRRSV GDr180毒株N蛋白基因序列克隆到p ET32a（+）载体中,在大肠杆菌BL21（DE3）细胞内实现了高效表达,表达形式为可溶性表达,通过Western blot证明表达产物与PRRSV GDr180株阳性血清具有很好的反应原性和特异性。将大肠杆菌表达的N蛋白经过超声、离心、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原检测血清中的PRRSV抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了能检测PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法;对方法的特异性和重复性以及与同类成品试剂盒间的应用效果对比进行了试验。结果表明,研究建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中PRRSV抗体、监测猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。

论文目录

• 1 材料
• 2 方法
•   2.1 重组蛋白基因质粒的构建
•     2.1.1 N基因片段的pcr扩增
•     2.1.2 p ET32a-PRRSV-N重组载体的构建与鉴定
•   2.2 重组蛋白的表达及纯化
•     2.2.1 重组N蛋白表达及SDS-PAGE鉴定
•     2.2.2 重组蛋白的Ni-NTA树脂纯化
•   2.3 重组蛋白的Western blot分析
•   2.4 ELISA反应条件的优化
•     2.4.1 通用的ELISA程序
•     2.4.2 抗原最适包被浓度和待检血清最佳稀释浓度的确定
•     2.4.3 包被方式的优化
•     2.4.4 封闭液的选择
•     2.4.5 抗原抗体最佳作用时间的确定
•     2.4.6 酶标抗体最佳作用时间确定
•     2.4.7 酶标抗体工作浓度优化
•     2.4.7 TMB底物反应时间的确定
•   2.5 临界值的确定
•   2.6 特异性检测
•   2.7 批内重复试验
•   2.9 与同种其他试剂盒之间的比较
• 3 结果
•   3.1 重组蛋白基因质粒的构建
•   3.2 重组蛋白的表达及纯化
•   3.3 重组蛋白的Western blot分析
•   3.4 ELISA反应条件的优化
•     3.4.1 抗原最适包被浓度和待检血清最佳稀释浓度的确定
•     3.4.2 包被方式的优化
•     3.4.3 封闭液的选择
•     3.4.4 抗原抗体最佳作用时间确定
•     3.4.5 酶标抗体最佳作用时间确定
•     3.4.6 酶标抗体工作浓度优化
•     3.4.6 TMB底物反应时间的确定
•   3.5 临界值的确定
•   3.6 特异性检测
•   3.7 批内重复试验
•   3.8 批间重复试验
•   3.9 与同种其他试剂盒之间的比较
• 4 分析与讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 陈汉锶,林旭埜,田允波,齐冬梅,邹伟斌,胡美容

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征

来源: 中国兽药杂志 2019年02期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 仲恺农业工程学院动物科技学院,广东永顺生物制药股份有限公司

基金: 猪重要疫病的诊断与检测新技术研究(2016YFD0500600)

分类号: S852.651

页码: 17-26

总页数: 10

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