基于基因编辑技术的家蚕重要经济性状遗传改良研究

论文摘要

家蚕是重要的经济昆虫。家蚕品种的性状决定蚕丝的产量、品质及后续产品的附加值增幅。因此,培育优良品种一直是蚕业工作者努力的目标。培育家蚕优良品种的传统方法主要是通过突变筛选获得期待的性状,再通过遗传杂交的方式将目标性状导入到各个生产品种之中。但是,这种方法受到多种因素的限制而影响育种周期。近年来,随着基因组测序工作的推进以及基因编辑技术在家蚕上的应用,为定向育种和加快育种进度奠定了良好的基础。本研究旨在瞄准家蚕产量和质量性状这两项重要内容进行研究:第一,利用转基因和基因编辑技术对家蚕保幼激素（Juvenile hormone,JH）和蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）信号通路中的关键基因进行功能研究,阐明JH和20E调控家蚕个体发育的分子机制,构建高产量的家蚕品系;第二,整合转基因、基因定点敲除和敲入等多种遗传操作手段构建家蚕雌性特异胚胎致死系统,实现专养雄蚕,提高蚕丝质量。相关研究成果可为家蚕经济性状改良提供理论基础,具体研究内容和结果如下:1.家蚕保幼激素代谢通路中BmJHE基因的功能研究保幼激素酯酶（JH esterase,JHE）是昆虫JH代谢通路中最为关键的代谢酶。本研究利用转基因CRISPR/Cas9技术敲除家蚕BmJHE基因,在个体水平分析了JH对家蚕体型大小的调控作用。BmJHE基因突变导致大龄幼虫发育时间延长。取食阶段的延长导致突变体体型大于对照组,雌性突变体全茧重增加47%,雄性突变体全茧重增加58%。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）结果发现突变体JH应答基因Krüppel homolog 1（Kr-h1）表达升高,表明JHE功能缺失引起JH降解的推迟,进一步通过控制幼虫发育时间影响体型大小。2.家蚕蜕皮激素合成通路中BmTorso基因的功能研究促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone,PTTH）受体Torso是一种受体酪氨酸激酶,位于20E合成通路的中间环节。本研究通过敲除家蚕BmTorso基因,发现BmTorso基因突变体幼虫和蛹期发育严重延迟。雌性突变体茧层重增加162%,雄性突变体茧层重增加167%。20E滴度水平检测表明,突变体血淋巴20E滴度在游走期和蛹期下调。qRT-PCR结果发现20E合成通路和下游应答基因的表达显著下调,转录组分析发现BmTorso基因调控前胸腺（Prothoracic gland,PG）长寿信号通路中相关基因的表达,表明BmTorso基因通过调控20E合成和长寿信号通路,从而控制发育时间和体型大小。3.家蚕雌性特异胚胎致死系统的构建研究雄性家蚕具有强健好养、出丝率高和蚕丝品质优等特点,选育雄蚕品系可以实现专养雄蚕进而提高茧丝品质。家蚕性染色体类型雌异质型,雄性为ZZ同配型,雌性为ZW异配型。本研究利用类转录激活因子核酸酶（transcriptional activator-like effector nuclease,TALENs）介导的定点插入技术,在家蚕W染色体插入生殖腺特异性启动子Nanos（Nos）驱动的Cas9表达框,获得了雌性特异表达Cas9的品系（W-Cas9）;同时,构建了家蚕胚胎致死基因transformer 2（BmTra2）特异性sgRNA表达的转基因品系（Tra2-sgRNAs/+）。研究结果显示W-Cas9和Tra2-sgRNAs杂交F1代蚕卵孵化率为50%;性别统计显示所有的雌性个体在胚胎期死亡,雄性个体孵化以及发育正常。本研究成功构建了家蚕雌性胚胎致死体系,为实现专养雄蚕、提高蚕丝品质提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 昆虫激素在调控体型大小方面发挥着中重要作用
•   1.2 保幼激素控制昆虫体型大小的研究进展
•     1.2.1 保幼激素的合成
•     1.2.2 保幼激素的代谢
•     1.2.3 保幼激素受体以及下游信号通路
•     1.2.4 保幼激素调节体型大小的研究进展
•   1.3 蜕皮激素控制昆虫体型大小的研究进展
•     1.3.1 蜕皮激素的合成
•     1.3.2 蜕皮激素的代谢
•     1.3.3 蜕皮激素受体以及下游信号通路的研究进展
•     1.3.4 蜕皮激素调控体型大小的研究进展
•   1.4 营养信号通路控制昆虫体型大小的研究进展
•   1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 家蚕保幼激素代谢通路中BmJHE基因的功能研究
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 材料
•     2.2.2 转基因质粒构建
•     2.2.3 遗传转化和转基因阳性个体筛选
•     2.2.4 RNA提取、纯化和cDNA合成
•     2.2.5 实时荧光定量PCR
•     2.2.6 基因组DNA提取
•     2.2.7 突变分析
•     2.2.8 反向PCR
•     2.2.9 保幼激素酯酶活性检测
•     2.2.10 转录组分析
•     2.2.11 幼虫生长情况统计
•     2.2.12 经济性状统计
•     2.2.13 数据分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 BmJHE-sgRNA转基因质粒的构建
•     2.3.2 转基因品系构建和插入位点检测
•     2.3.3 转基因CRISPR/Cas9介导BmJHE敲除和突变检测
•     2.3.4 BmJHE基因突变影响保幼激素酯酶酶活性
•     2.3.5 BmJHE基因突变延长家蚕幼虫生长周期
•     2.3.6 转录组分析筛选BmJHE突变体中的差异表达基因
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 家蚕蜕皮激素合成通路中BmTorso基因的功能研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 材料
•     3.2.2 转基因质粒构建
•     3.2.3 遗传转化和转基因阳性个体筛选
•     3.2.4 RNA提取、纯化和cDNA合成
•     3.2.5 实时荧光定量PCR
•     3.2.6 基因组DNA提取
•     3.2.7 突变分析
•     3.2.8 蜕皮激素滴度测定
•     3.2.9 蛋白提取
•     3.2.10 免疫印记分析
•     3.2.11 转录组分析
•     3.2.12 幼虫生长情况统计
•     3.2.13 经济性状统计
•     3.2.14 数据分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 BmTorso-sgRNA转基因质粒的构建
•     3.3.2 转基因品系构建和插入位点检测
•     3.3.3 转基因CRISPR/Cas9介导BmTorso敲除和突变检测
•     3.3.4 BmTorso突变延长家蚕幼虫发育时间
•     3.3.5 BmTorso基因突变对蜕皮激素滴度的影响
•     3.3.6 BmTorso基因突变对蜕皮激素信号通路基因表达的影响
•     3.3.7 转录组分析筛选BmTorso基因突变体中的差异表达基因
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 家蚕雌性特异胚胎致死系统的构建研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 材料
•     4.2.2 W染色体随机扩增多态性DNA标记Rikishi序列验证
•     4.2.3 类转录激活因子核酸酶表达质粒和活性检测质粒构建
•     4.2.4 类转录激活因子核酸酶切割活性检测
•     4.2.5 体外转录mRNA
•     4.2.6 配体质粒构建
•     4.2.7 特异性表达Tra2-sgRNA转基因质粒构建
•     4.2.8 类转录激活因子核酸酶介导的定点整合和阳性个体筛选
•     4.2.9 Tra2-sgRNA转基因质粒的遗传转化和转基因阳性个体筛选
•     4.2.10 反向PCR
•     4.2.11 定点插入位点检测和靶基因突变分析
•     4.2.12 RNA提取、纯化和cDNA合成
•     4.2.13 逆转录PCR
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 类转录激活因子核酸酶特异性靶点设计和配体质粒构建
•     4.3.2 雌性特异性表达荧光家蚕品系的构建
•     4.3.3 接头PCR验证W染色体特异性定点插入
•     4.3.4 雌性特异性胚胎致死品系的构建
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 总结与展望
•   5.1 研究总结
•   5.2 主要创新点
•   5.3 不足与展望
• 参考文献
• 附录一 实验主要药品试剂
• 附录二 实验主要仪器
• 附录三 攻读博士学位期间发表的学术论文及参与的项目
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张忠杰

导师: 李恺,谭安江

关键词: 家蚕,转基因,基因编辑,经济性状,遗传改良

来源: 华东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,蚕蜂与野生动物保护

单位: 华东师范大学

分类号: Q78;S882

总页数: 133

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