一种检测kras基因突变的新型TB-ARMS qPCR方法的建立

论文摘要

在荧光定量PCR基础上建立一种简单有效并且高度灵敏的TB-ARMSkras基因突变检测方法,并对其检测性能进行评估,探讨其临床应用价值。针对kras基因8种常见的点突变类型,通过设计并优化突变特异性引物、野生型特异性封闭引物并综合应用突变富集扩增反应条件等多种手段,提高点突变检测的灵敏度和特异性,采用已知野生型基因组样品和构建的突变质粒作为标准品,进行方法学评价;通过对临床样本的检测及与现有商品化试剂盒的比较进行性能验证;通过对术前血浆和配对组织样品的对比检测,评估方法是否适用于血液样本的检测。建立了TB-ARMS kras突变检测的新方法,能检测的最低突变率可达到0.01%。通过综合采用野生型特异性封闭引物和突变富集扩增条件等方法证明了其0.01%的突变检测灵敏度。检测准确性优于现有商品化试剂盒,血浆DNA TB-ARMS qPCR检测结果与配对组织DNA测序结果相符合。因此,TB-ARMS kras基因突变检测方法具有广泛的临床应用价值,既适用于临床组织样品的检测,也可应用于液体活检。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 基因组DNA和质粒标准品的制备
•   1.2 标准品的制备
•   1.3 肿瘤组织样品及血浆样品的收集和处理
•   1.4 新的kras突变检测方法的建立
•     1.4.1 引物设计及扩增
•     1.4.2 封闭引物增强kras点突变检测特异性的验证
•     1.4.3 引入适当突变碱基增强等位基因特异性引物检测特异性的验证
•     1.4.4 突变富集扩增反应条件与常规反应条件的比较
•   1.5 方法学评估
•     1.5.1 突变检测特异性分析
•     1.5.2 突变检测灵敏度的评价
•     1.5.3 两种检测方法对组织样品的检测比较
•     1.5.4 血浆和配对组织样品的对照分析
• 2 结果与分析
•   2.1 封闭引物增强kras基因点突变检测的特异性
•   2.2 突变碱基的引入可提高kras等位基因特异性引物突变检测的特异性和选择性
•   2.3 突变富集扩增反应条件与常规扩增条件的比较
•   2.4 突变检测特异性分析
•   2.5 突变检测的灵敏度评价
•   2.6 两种方法临床组织样本检测结果比较
•   2.7 血浆及配对组织DNA样品检测结果比较
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 于丽华,滕飞,蒋明,郭佳

关键词: 突变,突变检测,方法学,液体活检,个体化治疗

来源: 生物工程学报 2019年05期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 同济大学苏州研究院

基金: 江苏省自然科学基金青年基金(No.BK20150278),上海市科学技术委员会科研计划(No.19431903200)资助~~

分类号: Q503

DOI: 10.13345/j.cjb.180481

页码: 880-891

总页数: 12

文件大小: 672K

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