肝癌基因表达谱的生物信息学分析及关键基因的功能探讨

论文摘要

第一部分加权基因共表达网络（WGCNA）在肝癌基因表达谱中的应用目的:采用加权基因共表达网络等生物信息学方法研究肝癌基因表达谱与临床特征的关系。方法:从NCBI-GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）下载所有芯片数据及附带的临床信息,GSE14520为训练集、GSE6764、GSE76427及GSE54236验证集。对GSE14520原始数据CEL文件进行质量控制后,并用RMA算法对数据集进行背景校及标准化处理,利用R语言加载程序包“limma”进行分析差异表达基因,采用“WGCNA”程序包构建加权基因共表达网络,在模块-特征关系图中寻找最高相关性的显著性模块和临床特征,利用函数函数“networkScreening”寻找模块内枢纽基因,并结合蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络筛选出关键基因。对筛选出的关键基因进行COX比例风险模型（proportional hazards model,简称COX模型）建模,并对模型进行预后预测,GSE6764验证集对关键基因的临床分期进行验证、GSE76427及GSE54236验证集对模型的生存分析进行验证。结果:我们通过对训练集GSE1452的差异基因筛选,得到3670个差异基因,我们将差异基因作为目标基因构建WGCNA网络,鉴定了12个模块,其中红色模块与与临床特征PRMS（predicted metastasis signature）即转移风险相关性最高（R2=-0.74）,同时该模块在肿瘤大小（R2=-0.21）、Multinodular（R2=-0.16）、TNM.stage（R2=-0.31）对应的相关系数也是所有模块中的最大值,红色模块为显著性模块。通过进一步筛选,我们得到ABAT、AGXT、ALDH6A1、CYP4A11、DAO、EHHADH这6个关键基因,GSE6764验证集发现这6个基因肿瘤分期越高,表达越低（P<0.05）;6个基因进行COX建模,6基因模型ROC的AUC=0.704,C-index=0.694,预后分析提示,高风险组预后差,Log rank P=1.06×10-10,同时GSE76427及GSE54236验证集对模型的生存分析进行了验证。结论:通过对肝癌基因表达谱的采用WGCNA等高级生物信息学方法的分析,我们筛选出1个显著性模块,ABAT、AGXT、ALDH6A1、CYP4A11、DAO、EHHADH这6个关键基因,建立了肝癌的预后模型,为肝癌的预后提供了潜在的生物标记物。第二部分ABAT基因在肝癌中的表达水平及预后相关性目的:探讨ABAT基因在肝癌患者中的表达情况与临床特征及预后的相关性。方法:从NCBI-GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）下载所有芯片数据GSE14520及附带的临床信息,提取214例肝癌样本的基因表达谱及对应的临床信息,下载TCGA数据库中的肝癌数据及临床信息作为预后验证数据。首先通过Ocomine及GEPIA数据库对第一部分的6个关键基因进行基因表达水平分析,确立ABAT基因（探针号:209459sat）为研究的对象,根据ABAT基因表达值的中位值（9.26）,将肝癌患者分为ABAT基因高表达组（n=107）和低表达组（n=107）,比较2组的临床特征及预后,同时予以TCGA数据验证ABAT基因的预后情况,基因富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）可能存在的信号通路。结果:肝癌组织ABAT基因表达水平显著低于正常肝组织（P<0.05）,ABAT高表达组与AFP水平较低、肿瘤分期较好,转移风险较低,均有有显著性意义（P<0.05）,预后优于ABAT基因低表达组（P<0.05）,同时TCGA数据验证了ABAT基因的预后;多因素COX回归分析提示:ABAT基因高表达为预后的独立因素（P<0.05）;GSEA分析提示,ABAT基因高表达样本主要富集了过氧物酶体、Wnt信号通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、赖氨酸降解、酪氨酸代谢及PPAR信号通路相关的生物学过程。结论:ABAT基因在肝癌组织低表达,是肝癌患者预后的独立因素,ABAT基因高表达的肝癌患者预后优于低表达患者。第三部分ABAT基因在肝癌细胞中的表达及功能研究目的:探讨ABAT基因在肝癌细胞中的表达情况及其可能的机制。方法:qRT-PCR和Western blot检测ABAT基因在不同肝癌细胞株的表达,构建ABAT基因干扰细胞株,采用CCK-8及流式细胞仪检测细胞增殖、周期及凋亡;克隆形成实验、Transwell侵袭及迁移实验检测细胞的克隆形成、侵袭及迁移能力;Western blot检测Wnt/?-catenin信号通路及凋亡蛋白Cleaved caspase3的表达水平;结果:q RT-PCR和Western blot检测示,与正常肝细胞株L02相比,肝癌细胞株ABATm RNA的表达水平均出现不同程度的下调,Hep G2和SMMC-7721ABATm RNA相对其他2种肝癌细胞株较高,与正常肝细胞株L02相比,肝癌细胞株ABAT蛋白的表达水平均出现不同程度的下调,Hep G2和SMMC-7721ABAT蛋白相对其他2种肝癌细胞株较高,选取Hep G2和SMMC-7721作为后续实验肝癌细胞株;#2si RNA构建ABAT基因干扰细胞株,干扰ABAT基因后可显著增强Hep G2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖能力,抗凋亡能力、克隆形成、侵袭及迁移能力;干扰ABAT基因可增加肝癌细胞?-catenin、c-Myc水平,激活Wnt/?-catenin,降低Cleaved caspase3水平,抑制凋亡。结论:ABAT基因在肝癌细胞中表达下调,对肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移产生影响,可能与调控细胞的周期、细胞凋亡、Wnt/?-catenin信号通路的过程相关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 引言
• 第一部分 加权基因共表达网络（WGCNA）在肝癌基因表达谱中的应用
•   1.1 前言
•   1.2 材料与方法
•   1.3 结果
•   1.4 讨论
• 第二部分 ABAT基因在肝癌中的表达水平及预后相关性
•   2.1 前言
•   2.2 材料与方法
•   2.3 结果
•   2.4 讨论
• 第三部分 ABAT基因在肝癌细胞中的表达及功能研究
•   3.1 前言
•   3.2 材料与方法
•   3.3 结果
•   3.4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 攻博期间发表的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 陈鹏飞

导师: 赵秋

关键词: 加权基因共表达网络,差异表达基因,模块,预后,基因,基因富集分析,侵袭,增殖,转移

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 武汉大学

分类号: R735.7;Q811.4

总页数: 92

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