利用CRISPR-Cas9技术抑制狂犬病毒复制的研究

论文摘要

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）感染宿主而引起的一种传染性疾病,病死率高达100%。根据世界卫生组织（WTO）报道,全球每年约有59000人死于狂犬病,其中大部分来自于亚洲和非洲地区的发展中国家,而在亚洲地区狂犬病的高发区主要集中在印度和中国。虽然狂犬病疫苗的应用可以预防狂犬病病毒的传播,但狂犬病的治疗仍然面临诸多问题,目前常用的各种抗病毒疗法均未能成功治疗狂犬病。最近出现的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas9系统可以对任何物种基因组进行基因定点编辑,且较先前的基因编辑技术更为简单、快捷和高效,为诸多难以根治的病毒性感染、遗传病以及染色体缺陷等疾病的治疗带来了曙光。G蛋白是狂犬病病毒唯一的囊膜蛋白,是控制狂犬病病毒复制不可或缺的蛋白。G蛋白负责病毒吸附细胞入侵过程,因此作为狂犬病病毒的主要毒力蛋白。本研究利用CRISPR-Cas9定点剪切G蛋白,使其发生基因缺失,从而抑制病毒复制。本研究我们设计了4组对针对糖蛋白（G）的gRNA,构建作用于狂犬病毒糖蛋白的CRISPR-Cas9载体,用流式细胞术筛选出对病毒复制抑制效率较高的gRNA。之后用筛选出来的gRNA作用于SAD株、DRV株、CVS株和B2c株等不同毒株的狂犬病病毒,通过测序检测靶序列发现G蛋白发生序列部分缺失以及多处突变。最后模拟体内多次给药环境,我们将CRISPR-Cas9系统连续作用于狂犬病毒两次,发现CRISPR-Cas9可以显著抑制狂犬病病毒在胞内的复制。结果CRISPR-Cas9质粒PX459-gRNA构建成功,并筛选出PX459-G223作为最优gRNA;验证了构建的系统对狂犬病毒复制抑制的有效性,并且多次转染可以达到更好的效果。研究结果表明在RABV感染的细胞中CRISPR-Cas9系统能够破坏狂犬病病毒G蛋白基因组,从而在细胞水平上抑制狂犬病病毒的复制,这表明CRISPR-Cas9系统介导的G蛋白基因编辑为狂犬病基因治疗提供了可能性。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词表 Abbreviations
• 第一章 狂犬病和利用CRISPR-Cas9技术基因治疗的研究进展
•   1 狂犬病概述
•     1.1 狂犬病流行病学
•     1.2 狂犬病的临床特征
•   2 狂犬病病毒病原特征
•     2.1 狂犬病病毒的分类
•     2.2 狂犬病病毒的形态与结构
•     2.3 狂犬病病毒的基因组结构
•     2.4 狂犬病病毒各结构蛋白的功能
•   3 狂犬病病毒的感染和复制过程
•     3.1 狂犬病病毒的感染过程
•     3.2 病毒的复制过程
•   4 狂犬病的防预和治疗
•     4.1 狂犬病的防预
•     4.2 狂犬病的治疗
•   5 CRISPR-Cas9在基因编辑中的研究概述
•     5.1 CRISPR-Cas系统概述
•     5.2 CRISPR-Cas系统基本工作原理与特点
•     5.3 CRISPR-Cas9技术在RNA编辑中的应用
•     5.4 CRISPR-Cas9在基因治疗中的应用与展望
• 第二章 利用CRISPR-Cas9系统抑制狂犬病病毒复制的研究
•   前言
•   1 材料与方法
•     1.1 试验仪器与材料
•     1.2 试验方法
•   2 结果与分析
•     2.1 病料的采集与鉴定
•       2.1.1 病羊脑组织采取
•       2.1.2 PCR鉴定
•       2.1.3 直接免疫荧光鉴定
•     2.2 PX459-gRNA重组质粒构建
•       2.2.1 g RNA的设计
•       2.2.2 线性化PX459表达质粒制备
•       2.2.3 gRNA的连接与质粒鉴定
•     2.3 流式细胞术筛选高效率g RNA
•     2.4 细胞活力检测
•     2.5 gRNA活性检测
•       2.5.1 T7EN1检测gRNA活性
•       2.5.2 免疫荧光检测gRNA活性
•     2.6 测序验证CRISPR-Cas9抑制细胞内RABV的复制
•     2.7 细胞免疫反应检测
•     2.8 病毒滴度检测验证CRISPR-Cas9对狂犬病病毒的抑制
•     2.9 狂犬病病毒vRNA、cRNA、mRNA含量变化检测
•     2.10 CRISPR-Cas9对各基因型RABV的抑制效果
•   3 讨论
•     3.1 gRNA的筛选
•     3.2 PX459-G223gRNA介导的CRISPR-Cas9系统对RABV抑制效果的评价
•   4 结论与展望
•     结论
•     展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘晓燕

导师: 杨洋

关键词: 狂犬病毒,糖蛋白

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 内蒙古大学

分类号: S852.65

总页数: 67

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