A亚群禽白血病病毒（ALV-A）胶体金检测试纸条的研制

论文摘要

A亚群禽白血病是由A亚群禽白血病病毒（subgroup A of avian leukosis virus,ALV-A）引发的传染性肿瘤性疾病,主要引起感染鸡长期病毒血症、生长缓慢、免疫抑制、生产性能下降、多组织肿瘤甚至死亡等。该病在我国鸡群中感染率非常高,仅次于J亚群禽白血病,每年对我国的养鸡业造成巨大的经济损失。对该病尚无有效的药物和疫苗,采用淘汰阳性鸡、实施种鸡净化是目前控制该病的主要方法。建立特异、灵敏、快速检测ALV-A的方法是这一防控措施的关键核心技术。现有的检测ALV-A方法繁琐、需要特异设备、耗时长,很难满足临床大批量检测需要。本研究基于胶体金免疫结合和层析原理,通过制备ALV-A的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）,优化反应条件,研制ALV-A胶体金检测试纸条,对该试纸条性能进行比较分析,结合临床样品检测评价其适用性,为临床应用提供科学依据。本研究首先通过原核表达方法制备ALV-A gp85重组蛋白,纯化后免疫接种兔,四次免疫后取血清,制备pAb,ELISA方法检测抗体滴度和IFA法检测抗体特异性。用实验室制备的ALV-A单克隆杂交瘤细胞株A14GZ接种于Balb/c小鼠,制备腹水,获得ALV-A mAb,检测抗体滴度和抗体特异性。优化反应条件,利用一定大小的胶体金颗粒与mAb制备纳米胶体金标记抗体溶液。pAb包被试纸条硝酸纤维素膜（NC膜）,按照胶体金检测试纸条制备方法研制ALV-A胶体金检测试纸条。用已知的ALV-A/B/J/K毒株检测胶体金检测试纸条的特异性,用一定量含ALV-A病毒稀释液和gp85蛋白检测试纸条的灵敏度,在4℃、25℃、37℃条件下分别保存试纸条6个月,用已知ALV-A病毒溶液检测试纸条的稳定性。收集ALV-A病毒感染种鸡的血液、泄殖腔棉拭子、蛋清样品,用研制的胶体金试纸条与IDEXX公司的ALV p27抗原ELISA检测试剂盒进行比较检测,评价试纸条的适用性,分析结果。结果显示:（1）制备的ALV-A gp85蛋白的大小为46 KDa,获得的pAb和mAb的抗体滴度分别为1:106和1:213,IFA和Western-blot结果显示两种抗体均特异性的结合ALV-A和gp85包膜蛋白。（2）采用氯金酸和柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液的胶体金颗粒大小为20 nm;用mAb和pAb分别作为标记抗体和检测抗体,胶体金-抗体复合物反应体系的最佳pH值为8.3,抗体的最佳工作浓度为16.8μg/mL。（3）该试纸条能特异性识别ALV-A,但不能识别ALV-B/J/K;对ALV-A的检测下限为64 TCID50/mL,对ALV-A gp85蛋白的检测下限为80 ng/mL;在4℃保存180 d、25℃保存60 d以及37℃保存15 d都具有较好的反应性。（4）该胶体金检测试纸条与国际商业化ALV抗原ELISA检测试剂盒比较结果显示,二者泄殖腔棉拭子样本阳性和阴性重合率为94.06%（190/202）,血液样本为95.2%（119/125）,蛋清样本为95.31%（61/64）;而PCR结果显示,试纸条的假阳性率远低于ELISA。同时,所研制的试纸条具有检测快速、成本低廉、不需特殊设备等优点。以上结果表明:成功研制ALV-A的纳米胶体金检测试纸条,具有特异、灵敏、快速检测ALV-A的特性,可适用于ALV-A的临床批量样本检测。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
•   1.1 ALV
•     1.1.1 ALV病原学
•     1.1.2 ALV流行病学
•     1.1.3 ALV的致病性及危害
•     1.1.4 ALV的诊断检测方法
•       1.1.4.1 病毒分离鉴定
•       1.1.4.2 分子生物学法
•       1.1.4.3 血清学检测方法
•     1.1.4.3.1 ELISA法
•     1.1.4.3.2 IFA法
•     1.1.5 ALV的防控
•     1.1.6 ALV临床防控面临的主要科学问题
•   1.2 胶体金检测试纸条研究及应用进展
•     1.2.1 胶体金检测试纸条技术
•       1.2.1.1 胶体金检测试纸条的检测原理
•       1.2.1.2 胶体金溶液的制备及特点
•       1.2.1.3 胶体金检测试纸条的结构
•     1.2.2 胶体金检测试纸条在人类医学中的应用
•     1.2.3 胶体金检测试纸条在畜禽疾病检测中的应用
•     1.2.4 胶体金检测试纸条临床应用过程中的主要问题
•   1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 病毒和细胞来源
•     2.1.2 菌种和载体质粒
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 实验动物
•     2.1.5 主要仪器
•     2.1.6 实验地点
•   2.2 方法
•     2.2.1 ALV-A多克隆抗体的制备
•       2.2.1.1 gp85 重组蛋白的制备
•       2.2.1.2 gp85 重组蛋白的纯化
•       2.2.1.3 ALV-A gp85 重组蛋白多克隆抗体的制备
•     2.2.2 ALV-A单克隆抗体制备
•     2.2.3 胶体金溶液的制备及反应条件的优化
•       2.2.3.1 胶体金溶液的制备
•       2.2.3.2 胶体金和抗体结合的最佳pH值的确定
•       2.2.3.3 胶体金和抗体结合的最佳抗体浓度的确定
•       2.2.3.4 胶体金抗体复合物的制备
•     2.2.4 胶体金检测试纸条组装
•       2.2.4.1 试纸条材料的选择处理
•       2.2.4.2 NC膜上抗体包被量的确定
•       2.2.4.3 胶体金检测试纸条的组装
•     2.2.5 胶体金检测试纸条的特异性分析
•     2.2.6 胶体金检测试纸条的灵敏度分析
•     2.2.7 胶体金检测试纸条的稳定性分析
•     2.2.8 胶体金检测试纸条临床样品检测
•   2.3 数据分析
• 3 结果与分析
•   3.1 ALV-A gp85 抗体的制备纯化及验证
•     3.1.1 ALV-A gp85 重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
•     3.1.2 抗体的纯度检测
•     3.1.3 抗体滴度的测定
•     3.1.4 抗体的Western-blot分析
•     3.1.5 抗体的IFA鉴定
•   3.2 胶体金检测试纸条的制备
•     3.2.1 胶体金溶液的制备
•     3.2.2 胶体金与抗体标记的最佳pH值的确定
•     3.2.3 胶体金与抗体标记的最佳抗体浓度的确定
•     3.2.4 金标抗体的制备
•     3.2.5 NC膜抗体包被量的确定
•   3.3 胶体金检测试纸条的性能评估
•     3.3.1 胶体金检测试纸条特异性的检测
•     3.3.2 胶体金检测试纸条的灵敏度检测
•     3.3.3 胶体金检测试纸条稳定性检测
•   3.4 胶体金检测试纸条临床样本检测
• 4 讨论
•   4.1 ALV-A抗体对胶体金检测试纸条的影响
•   4.2 ALV-A胶体金检测试纸条的制备
•   4.3 ALV-A胶体金检测试纸条与目前其他ALV-A检测方法比较
•     4.3.1 特异性
•     4.3.2 灵敏度
•     4.3.3 稳定性
•     4.3.4 使用快速方便方面
•     4.3.5 检测成本与适用方面
•   4.4 前景与展望
• 5 结论
• 6 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 胡卫国

导师: 郭慧君

关键词: 亚群禽白血病病毒,胶体金检测试纸条,单克隆抗体,多克隆抗体

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家重点研发专项(2016YFD0500800),国家林业局中央本级专项(20130211)

分类号: S852.65;S852.4

总页数: 60

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