木糖苷酶JB13GH39的功能和分子特性研究

论文摘要

木聚糖是含量最高的半纤维素,大量的农业生物质和工业废弃物中含有木聚糖。木聚糖经内切木聚糖酶降解后生成木寡糖,木寡糖需经β-1,4-木糖苷酶进一步催化降解生成木糖。工程改造的酵母可发酵木糖产木糖醇、乳酸、乙醇和其它物质,该过程需要在低pH、中低温或高浓度乙醇的条件下进行;面包、盐渍食物制作及其它食品加工过程中,具低温活性、耐盐和耐蛋白酶功能的β-木糖苷酶很重要;有些木糖苷酶具有转糖基或转化三七皂苷R1和R2的作用,其产物均有潜在应用价值,例如转化三七皂苷R1和R2分别生成的人参皂苷Rg1和Rh1就有抗癌和抗氧化等功能。因此,具有以上功能特性的β-木糖苷酶在食品、饲料和医药等行业都具有巨大的应用潜力;研究相关功能对应的分子特性,可增加对酶功能适应性机理的认识,从而指导酶的分子设计,具有重要理论研究价值;目前,同时具有以上功能特性的β-木糖苷酶及其作用机理还尚未报导。本实验室前期获得了Sphingomonas sp.JB13,其是一个潜在新种,本实验室已从该菌株中获得了低温、耐盐等功能的外切菊粉酶、半乳糖苷酶和甘露聚糖酶。在该菌株基因组中,有且只有1个序列新颖的糖苷水解酶第39家族（GH39）蛋白,其与数据库中序列的最高一致性为75.9%。通过底物特异性分析,发现该蛋白具有β-1,4-木糖苷酶活性。基于菌株JB13的新颖性、菌株JB13中其它酶类功能的新颖性及该木糖苷酶序列的新颖性,推测该木糖苷酶应该具有新颖的或特殊的功能及分子特性,亟需对其进行研究。因此,本研究对其功能和分子特性的研究如下:1.β-木糖苷酶JB13GH39的功能研究。将该β-木糖苷酶基因jb13GH39连接到pEASY-E2载体上,转化大肠杆菌进行表达、纯化后得到重组酶rJB13GH39。该酶具有如下功能特性:最适pH 4.5,在pH 4.0-9.0下保持稳定;最适温度50°C,在0-20°C仍能保持10.0%-50.0%的活性;大多数盐和化学试剂对其无影响:在反应体系中加入3.0%-20.0%（w/v）的NaCl,其活性几乎不受影响;在10.0%和15.0%（v/v）乙醇中的活性分别为71.9%和55.2%;经3.0%-30.0%（w/v）的NaCl、3.0%-20.0%（v/v）的乙醇或2.2-87.0 mg/mL的胰蛋白酶处理1 h后,该酶保持稳定。该酶能催化木糖基转移到特定的糖或醇上,形成新的功能产物,例如形成木糖葡萄糖、木糖乙醇;该酶能降解oNPX,并能将三七皂苷R1和R2分别转化为稀少的人参皂苷Rg1和Rh1。2.β-木糖苷酶JB13GH39的分子特性研究。分析比较JB13GH39及同家族β-木糖苷酶的序列及高级结构,发现该酶具有高比例的小氨基酸（ACDGNSTV）和无规则卷曲,导致其高级结构具有高度柔性,进而使其催化能障降低、内部疏水作用及静电相互作用减弱,这是其具有耐盐、耐乙醇和低温活性的分子机理。rJB13GH39能转化三七皂苷R1和R2分别生成人参皂苷Rg1和Rh1,是因为该酶具有β-1,2-糖苷键水解活性,具体是切割木糖和葡萄糖之间的β-1,2-糖苷键。为了研究该酶具有β-1,2-木糖苷酶活性的分子基础,用β-1,2-糖苷键连接的木糖-葡萄糖作为配体进行酶-配体分子对接,发现该酶中的7个氨基酸位点与配体形成氢键的频率较高。β-1,2-木糖苷酶活性并不是JB13GH39的特有活性,一些已报导的其它GH39β-木糖苷酶也具有该活性,所以对已报导的且确定具有β-1,2-木糖苷酶或β-1,4-木糖苷酶活性的14个GH39β-木糖苷酶进行序列保守位点分析,发现涉及β-1,2-木糖苷酶活性的7个保守氨基酸位点,其中有5个是不变的,其余2个可以改变。2个可变保守氨基酸位点是Ps266和Ps322,即分别对应JB13GH39与木糖-葡萄糖分子对接中与氢结合频率较低的Tyr257和Tyr311。进一步,通过系统发育树分析,同时结合序列保守位点分析和酶-配体分子对接结果,推测已明确具有β-1,4-木糖苷酶活性的GH39β-木糖苷酶应该都具有β-1,2-木糖苷酶活性。将JB13GH39中的Tyr257和Tyr311分别突变为苏氨酸（Thr）和脯氨酸（Pro）进行验证,发现这2个突变体仍有β-1,4-木糖苷酶和β-1,2-木糖苷酶活性,但是活性降低。此外,在国际生物化学联合会酶委员会对酶的功能分类中,β-1,2-木糖苷酶活性还未被记录。因此,本研究提出β-1,2-木糖苷酶活性应该被国际生物化学联合会酶委员会列为一个新的水解酶子类,并以GH39β-木糖苷酶作为本类代表。综上所述,（1）本研究获得一个新型的多功能β-木糖苷酶,即耐盐、耐乙醇、耐胰蛋白酶、低pH、低温、转糖基及β-1,2-糖苷键水解活性的β-木糖苷酶,其可应用于食品、酿造、生物能源及医药行业,特别适合应用于酵母发酵酒精的糖化过程、含木糖的醇类制备及三七皂苷酶法转化。（2）该酶具有高比例的小氨基酸和无规则卷曲,增强了其结构的柔性,是其具有耐盐、耐乙醇、低温活性的分子基础。（3）转化三七皂苷或β-1,2-木糖苷酶活性的分子特性。本研究提出了GH39β-木糖苷酶均有β-1,2-木糖苷酶活性,该活性应被列为新的水解酶子类,该活性涉及到GH39β-木糖苷酶的7个保守氨基酸:His88（Ps88）、Glu189（Ps195）、Tyr257（Ps266）、Glu306（Ps317）、Tyr311（Ps322）、Trp344（Ps356）和Glu35（Ps364）。揭示该酶的分子特性为木糖苷酶的分子设计、改性提供理论基础,同时增加了对酶功能适应机理的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 术语及符号说明
• 第1章 绪论
•   1.1 木聚糖
•     1.1.1 研究背景
•     1.1.2 木聚糖的结构与分类
•     1.1.3 木聚糖的功能
•     1.1.4 含木糖基的其它物质
•   1.2 木糖苷酶的研究概况
•   1.3 大肠杆菌异源表达概述
•   1.4 定点突变技术概述
•   1.5 研究的背景、意义与目的
•     1.5.1 研究的背景与意义
•     1.5.2 研究目的
•   1.6 研究内容
• 第2章 JB13GH39 的异源表达和功能特性研究
•   2.1 实验用品
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 试剂
•     2.1.3 器材
•     2.1.4 主要溶液及配制方法
•     2.1.5 主要培养基及配制方法
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 基因预测
•     2.2.2 重组β-木糖苷酶的异源表达、纯化和鉴定
•     2.2.3 酶活测定和底物特异性测定方法
•     2.2.4 酶学特性测定
•     2.2.5 转糖基分析
•     2.2.6 转化三七皂苷的活性测定
•   2.3 实验结果和讨论
•     2.3.1 基因预测
•     2.3.2 rJB13GH39 的表达、纯化和鉴定
•     2.3.3 底物特异性
•     2.3.4 酶学性质
•     2.3.5 转糖基活性
•     2.3.6 转化三七皂苷的活性
•   2.4 本章小结
• 第3章 JB13GH39 的分子特性研究
•   3.1 实验用品
•     3.1.1 菌株
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要溶液及配制方法
•     3.1.4 主要培养基及配制方法
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 JB13GH39 具低温、耐盐和耐乙醇的分子特性
•     3.2.2 JB13GH39 转化三七皂苷的分子特性
•     3.2.3 GH39β-木糖苷酶的β-1,2-木糖苷酶活性
•   3.3 实验结果与讨论
•     3.3.1 JB13GH39 具低温、耐盐和耐乙醇的分子特性
•     3.3.2 JB13GH39 转化三七皂苷的分子特性
•     3.3.3 GH39β-木糖苷酶的β-1,2-木糖苷酶活性
•   3.4 本章小结
• 第4章 总结、创新与展望
•   4.1 总结
•   4.2 创新
•   4.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果
• 附录A 木糖苷酶及突变子氨基酸序列
• 附录B 氨基酸缩写及中英文全称
• 附录C 转糖基产物的ESI-MS分析结果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李娜

导师: 周峻沛,黄遵锡

关键词: 木糖苷酶,功能,机理,糖苷水解酶

来源: 云南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 云南师范大学

分类号: Q78

总页数: 115

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