RPA伴侣蛋白Rtt105在DNA双链断裂修复中的作用与机制研究

论文摘要

同源重组和非同源末端连接是修复DNA双链断裂主要的两条途径。同源重组修复过程相对更加复杂,涉及到的蛋白也较多。其中,RPA是同源重组中的关键蛋白之一,能够结合并保护单链DNA（ssDNA）,介导细胞周期检查点的激活,参与DNA复制、转录、同源重组以及DNA损伤与修复等DNA代谢过程。Rtt105作为RPA的伴侣蛋白,参与了DNA的复制过程;为进一步了解Rtt105作为RPA伴侣蛋白在细胞其他代谢过程中的功能,我们对其在同源重组修复中的作用和机制进行了探究,得到了以下几个结论:1.Rtt105参与DNA损伤修复。我们通过药物敏感性实验发现RTT105缺失的细胞对DNA损伤药物高度敏感;短时间的药物处理后,与野生型细胞相比,RTT105敲除突变体细胞存活率显著下降,说明Rtt105在DNA损伤应答中发挥重要作用。另外,我们发现RTT105敲除突变体中自发形成的Rad52-YFP聚集点（foci）显著高于野生型细胞,说明突变体细胞中积累大量自发性的DNA损伤;我们还发现Rtt105促进DNA损伤后的恢复,并通过脉冲场凝胶电泳实验进一步确定该结果。2.Rtt105促进同源重组修复DNA双链断裂。我们通过检测DNA双链断裂后细胞利用同源重组进行修复的效率,发现RTT105敲除后同源重组修复效率显著下降,说明Rtt105促进同源重组修复。通过基因打靶实验进一步确定了Rtt105能够促进同源重组过程。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验显示Rtt105会结合到DNA双链断裂末端,这一过程依赖于DNA双链断裂的末端剪切过程,但不依赖于细胞周期的调控。另外,敲除RTT105后会导致酵母人工染色体（YAC）丢失增加,说明Rtt105有助于维持基因组的稳定性。3.Rtt105调控Rfa1的入核定位。我们发现在RTT105敲除突变体中,DNA损伤引起的Rad53磷酸化正常,表明Rtt105不影响细胞周期检查点的激活。利用荧光显微镜,我们观察发现在野生型细胞中,Rfa1基本上完全分布在细胞核中,而在RTT105敲除突变体中,Rfa1在细胞核和细胞质中均有分布,说明Rtt105能够促进Rfa1的入核定位。进一步研究发现在RTT105敲除细胞里,在Rfa1的N端融合入核定位信号序列能够回复Rfa1的入核定位缺陷。RTT105的两点突变（rtt105-E171AL172A）与Rfa1的互作明显减弱,我们发现两点突变并不影响Rfa1的入核定位,但是两点突变中同源重组仍然缺陷,说明Rtt105促进Rfa1入核定位并不依赖和Rfa1的互作;同时也说明Rtt105促进同源重组修复并不主要依赖于其对Rfa1入核定位的影响,暗示了Rfa1-Rtt105互作可能具有其他功能。4.Rtt105促进Rfa1和Rad51在DNA双链断裂末端的结合。我们通过染色质免疫共沉淀实验发现,Rtt105促进Rfa1和Rad51在DNA双链断裂末端结合。两点突变的细胞里Rfa1在DNA双链断裂的末端结合量相比野生型显著下降,说明Rtt105和Rfa1的互作有助于Rfa1结合到DNA双链断裂末端。我们发现在Rfa1融合了入核定位信号序列的RTT105敲除细胞里,能部分回复Rfa1在DNA双链断裂末端的结合缺陷,说明Rtt105调控Rfa1的入核定位也有助于Rfa1在DNA双链断裂末端结合。5.Rtt105的C端促进DNA双链断裂修复。通过荧光显微镜观察Rfa1的入核定位,我们发现Rtt105的C端的155-175这二十个氨基酸对于促进Rfa1的入核定位至关重要;另外,我们发现这一区间对于促进DNA损伤修复和同源重组修复也至关重要。以上结果说明Rtt105通过控制RPA的行为,包括控制RPA的入核定位,帮助RPA在DNA双链断裂末端结合等方式来影响RPA的功能进而影响同源重组修复过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章：引言
•   1.1 DNA双链断裂
•   1.2 非同源末端连接
•   1.3 同源重组
•     1.3.1 dHJ模型
•     1.3.2 单链结合蛋白RPA
•   1.4 Rtt105蛋白的发现及研究进展
•   1.5 研究目的与意义
• 第二章：材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 常用培养基配制方法
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 引物设计
•     2.2.2 酵母转化
•     2.2.3 酵母基因组的简单提取
•     2.2.4 常规PCR与琼脂糖凝胶电泳
•     2.2.5 Hot Fusion技术构建载体
•     2.2.6 Western Blot
•     2.2.7 Southern Blot
•     2.2.8 药物敏感性实验
•     2.2.9 DAPI染色
•     2.2.10 质粒NHEJ修复效率检测
•     2.2.11 脉冲场凝胶电泳
•     2.2.12 染色质免疫共沉淀
• 第三章：结果与分析
•   3.1 Rtt105促进DNA损伤修复
•     3.1.1 Rtt105促进DNA损伤修复
•     3.1.2 Rtt105在应对短时间的DNA损伤处理条件下也发挥作用
•     3.1.3 Rtt105参与DNA损伤修复
•     3.1.4 Rtt105参与维持基因组稳定性
•   3.2 Rtt105促进DNA双链断裂修复
•     3.2.1 Rtt105促进核酸内切酶导致的DNA双链断裂修复
•     3.2.2 Rtt105促进基因打靶
•     3.2.3 Rtt105结合DNA双链断裂末端依赖于剪切
•   3.3 Rtt105不影响细胞周期检查点的激活
•     3.3.1 RTT105敲除对细胞周期没有明显影响
•     3.3.2 Rtt105敲除的细胞里细胞周期检查点能够正常激活
•     3.3.3 细胞周期检查点的丧失不影响Rtt105在DNA双链断裂末端的招募
•   3.4 Rtt105促进RPA的入核定位
•     3.4.1 Rtt105帮助RPA在核内集中
•     3.4.2 Rtt105调控RPA入核定位不受Rtt105与Rfa1互作的影响
•     3.4.3 Rtt105促进同源重组修复主要不依赖于RPA的入核
•   3.5 Rtt105促进RPA和Rad51在DNA双链断裂末端的招募
•     3.5.1 Rtt105促进RPA在DNA双链断裂末端的招募
•     3.5.2 Rtt105促进Rad51在DNA双链断裂末端的招募
•   3.6 Rtt105的155-175氨基酸对于同源重组修复至关重要
•     3.6.1 Rtt105的155-175氨基酸参与DNA损伤修复
•     3.6.2 Rtt105的第155-175个氨基酸参与Rtt105对RPA的入核定位调控
•     3.6.3 Rtt105的第155-175个氨基酸对于同源重组修复至关重要
•     3.6.4 Rtt105影响非同源末端连接
• 第四章：总结与讨论
•   （1）过表达Rtt105不影响DNA损伤修复
•   （2）Rtt105通过其他途径影响Rad51在DNA双链断裂末端的结合
•   （3）Rtt105影响RPA的构象改变
•   （4）入核定位对DNA损伤修复的影响
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李金保

导师: 陈学峰

关键词: 双链断裂,同源重组,入核定位

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q75

总页数: 76

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