多序列比对在克隆表达一株未知芽孢杆菌角蛋白酶基因中的应用

论文摘要

为克隆表达一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,本文对芽孢杆菌属来源的13个角蛋白酶基因进行了分类比对,并设计简并引物,成功筛选出一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,在大肠杆菌中克隆表达,最后通过SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）分析和酶活测定验证表达成功,同时还确立重组大肠杆菌BL21（pET-28a-Ker）的最佳诱导温度为20℃,经过0.5 mmol/L IPTG（isopropylthio-galactoside）诱导16 h后,粗酶液中的角蛋白酶酶活达到389.7 U/mL。本文证明了通过多序列比对而设计的角蛋白酶简并引物的有效性,且该方法能够简化角蛋白酶的研究和开发。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料与仪器
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 培养基配制
•     1.2.2 利用生物信息学工具设计未知角蛋白酶基因的简并引物
•       1.2.2.1 多种来源的角蛋白酶序列进化树分析
•       1.2.2.2 芽孢杆菌来源的角蛋白酶多序列比对
•       1.2.2.3 简并引物的设计
•     1.2.3 角蛋白酶基因完整序列的PCR扩增
•       1.2.3.1 芽孢杆菌的培养及其全基因组的提取
•       1.2.3.2 角蛋白酶基因的扩增
•     1.2.4 角蛋白酶基因的克隆
•     1.2.5 重组大肠杆菌BL21（pET-28a-CDJYB）诱导表达及SDS-PAGE分析
•     1.2.6 不同温度条件下的蛋白表达量的SDS-PAGE分析及酶活测定
•       1.2.6.1 蛋白表达量的SDS-PAGE分析
•       1.2.6.2 酪氨酸福林酚标准曲线的绘制及角蛋白酶酶活的测定
•   1.3 数据处理
• 2 结果与分析
•   2.1 角蛋白酶序列的系统进化树
•   2.2 角蛋白酶序列多序列比对
•   2.3 简并引物的设计
•   2.4 蛋白酶基因PCR扩增结果
•   2.5 克隆及表达载体的构建
•   2.6 重组大肠杆菌BL21（pET-28a-Ker）表达产物的SDS-PAGE分析结果
•   2.7 不同温度条件下的蛋白表达SDS-PAGE分析结果
•   2.8 酪氨酸-福林酚反应标准曲线及角蛋白酶酶活测定
• 3 结论与讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 蒋少龙,郭依依,蔡俊

关键词: 多序列比对,角蛋白酶,芽孢杆菌,简并引物

来源: 食品工业科技 2019年24期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心工业微生物湖北省重点实验室

分类号: Q78;TS201.2

DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2019.24.013

页码: 74-81+87

总页数: 9

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