黄病毒复制缺陷病毒的构建及sfRNA产生机制研究

论文摘要

黄病毒是黄病毒科黄病毒属病毒的统称,为单链正义RNA病毒,是一类重要的引起人类疾病的虫媒病毒,主要包括西尼罗病毒、黄热病毒、登革病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒等,在世界范围内分布广泛,严重危害人类的生命健康。目前,大多数黄病毒缺乏有效的疫苗和抗病毒药物,并且蚊虫和蜱虫是黄病毒的主要传播媒介,进一步增大了控制病毒传播及疾病预防的难度。因此,建立有效的抗病毒药物筛选平台、研究黄病毒的致病机制具有重要意义。鄂木斯克出血热病毒（Omsk hemorrhagic fever virus,OHFV）是一种由蜱虫传播的生物安全四级（Biosafety level 4,BSL4）的病原体,主要引起发热、头痛、咳嗽、肌痛、出血等症状,有时出现脑膜炎并伴有神经系统损害,严重威胁人类健康。在生物安全等级四级实验室进行病毒学操作极大限制了OHFV的研究。目前,针对OHFV病毒的感染,尚无商业化的疫苗和抗病毒药物。在本论文中,利用OHFV感染性克隆,我们构建了NS1基因缺失的OHFV复制缺陷病毒（OHFV-?NS1）和复制缺陷的Gaussia荧光素酶（Gluc）报告病毒（OHFV-?NS1-Gluc）。这两种缺陷病毒只能在稳定表达NS1的BHK-21细胞系(BHK-21NS1)中复制增殖,在野生型的BHK-21细胞中不能产毒,同时Gluc报告基因的表达可有效表征病毒的复制。利用OHFV-?NS1-Gluc报告病毒,我们建立了基于96孔板的高通量药物筛选方法。OHFV复制缺陷病毒的成功构建为我们在BSL2实验室研究OHFV的复制机制、致病机理及高通量药物筛选提供了平台。sfRNA（subgenomic flavivirus RNA,sfRNA）是近年新发现的黄病毒重要的毒力因子之一,sfRNA是由宿主5?-3?核酸外切酶XRN1不完全切割病毒基因组RNA形成的非编码RNA。sfRNA可参与细胞内的I型干扰素反应和RNAi等,影响病毒的致病性。前期文献表明,sfRNA的产生是由3?UTR保守的茎环结构（SLII/SLIV）和哑铃结构（DB1/DB2）阻止XRN1的切割而形成。本论文研究发现了一组新的位于黄病毒3?UTR的二级结构可影响sfRNA的产生。我们发现实验室已有的两株西尼罗病毒（WNV和WNVa）对小鼠的致病性与sfRNA产生具有相关性。通过全基因组序列比对、感染性克隆突变验证、小鼠毒力实验以及sfRNA检测等一系列实验,证明病毒基因组的10577位点是影响sfRNA1产生及病毒致病性的关键位点。分析发现10577位于3?UTR的RCS3区,我们利用突变的重组病毒证明了RCS3序列的缺失影响病毒sfRNA1的产生。RCS3环区及茎区的一系列突变表明:RCS3的茎区配对是sfRNA1产生所必需的,而环区序列不是sfRNA1产生的必要条件。通过黄病毒3?UTR序列分析,我们发现CS序列在不同黄病毒中均比较保守,继而验证了WNV CS3、RCS2和CS2序列缺失的病毒分别影响sfRNA2/3/4条带的产生。通过多位点突变,我们也验证了WNV CS3的茎区配对是sfRNA2产生的必要条件。我们在ZIKV及DENV2病毒中也进一步验证了RCS3和CS3保守结构影响sfRNA的产生。我们首次系统验证了黄病毒属不同种病毒的CS保守序列对sfRNA的产生有影响,为黄病毒减毒疫苗的研发和治疗提供了新的位点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
•   1.1 黄病毒的生物学特性
•     1.1.1 黄病毒分类及流行概况
•     1.1.2 黄病毒形态、结构及理化性质
•     1.1.3 黄病毒的基因组结构和功能
•     1.1.4 黄病毒的蛋白结构和功能
•       1.1.4.1 黄病毒结构蛋白功能介绍
•       1.1.4.2 非结构蛋白功能介绍
•     1.1.5 黄病毒的生命周期
•   1.2 假病毒系统的研究进展
•     1.2.1 复制子系统
•     1.2.2 病毒样颗粒系统
•     1.2.3 复制缺陷病毒系统
•   1.3 亚基因组RNA的研究进展
•     1.3.1 黄病毒亚基因组RNA的起源
•     1.3.2 亚基因组RNA的产生机制
•       1.3.2.1 核酸外切酶切割
•       1.3.2.2 sfRNA产生所需的RNA高级结构
•     1.3.3 亚基因组RNA与病毒复制
•     1.3.4 亚基因组RNA与RNAi反应
•     1.3.5 亚基因组RNA抑制I型IFN反应
•     1.3.6 亚基因组RNA与病毒致病性
•   1.4 本论文的主要内容
•     1.4.1 选题的背景和意义
•     1.4.2 本论文所要解决的关键科学问题
•     1.4.3 本论文的结论
• 第二章 鄂木斯克出血热复制缺陷病毒的构建和应用
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验仪器
•     2.1.2 菌株、细胞系、抗体和药物
•       2.1.2.1 菌株
•       2.1.2.2 细胞系
•       2.1.2.3 抗体
•       2.1.2.4 药物
•     2.1.3 化学试剂和试剂盒
•       2.1.3.1 化学试剂
•       2.1.3.2 试剂盒
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 DNA片段的琼脂糖凝胶回收
•     2.2.2 质粒的构建
•       2.2.2.1 OHFV-?NS1及OHFV-?NS1-Gluc克隆构建
•       2.2.2.2 p BABEpuro-OHFV-NS1克隆的构建
•     2.2.3 质粒的提取（大量）
•     2.2.4 质粒的线性化和酚氯仿抽提
•     2.2.5 RNA的体外转录
•     2.2.6 细胞培养
•     2.2.7 DNA转染BHK-21 细胞
•     2.2.8 RNA脂质体转染细胞（BHK-21 和BHK-21NS1）
•     2.2.9 间接免疫荧光实验 （Indirect immunofluorescence assay, IFA）
•     2.2.10 免疫印迹实验（Western blotting，WB）
•     2.2.11 稳定表达NS1的BHK-21 细胞系的筛选
•       2.2.11.1 表达有NS1蛋白的逆转录病毒的包装
•       2.2.11.2 逆转录病毒感染
•       2.2.11.3 稳定表达NS1蛋白的细胞系筛选
•     2.2.12 缺陷病毒滴度测定
•     2.2.13 缺陷病毒生长曲线测定
•     2.2.14 Gluc信号值的测定
•     2.2.15 细胞总RNA的提取
•     2.2.16 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
•     2.2.17 抗病毒药物实验
•     2.2.18 高通量药物筛选实验条件的优化
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 NS1表达质粒可反式互补复制缺陷的OHFV-?NS1
•     2.3.2 稳定表达NS1细胞系的筛选及验证
•     2.3.3 OHFV-?NS1缺陷病毒的特征
•     2.3.4 OHFV-?NS1缺陷病毒稳定性和安全性鉴定
•     2.3.5 OHFV-?NS1-Gluc缺陷病毒的产生及特征鉴定
•     2.3.6 OHFV-?NS1-Gluc缺陷病毒可用于高通量抗病毒药物的筛选
•   2.4 讨论
• 第三章 黄病毒 3￠UTR重复序列影响sfRNA的产生
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验仪器
•     3.1.2 菌株、细胞系、病毒
•       3.1.2.1 菌株
•       3.1.2.2 细胞系
•       3.1.2.3 病毒
•     3.1.3 化学试剂和试剂盒
•       3.1.3.1 化学试剂
•       3.1.3.2 试剂盒
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 DNA片段的回收
•     3.2.2 质粒的构建
•     3.2.3 质粒的大量提取、线性化及酚氯仿抽提
•     3.2.4 T7启动子感染性克隆RNA的体外转录及转染产毒
•     3.2.5 CMV启动子感染性克隆DNA转染产毒
•     3.2.6 细胞培养
•     3.2.7 病毒感染、噬斑实验及生长曲线测定
•     3.2.8 细胞总RNA的提取
•     3.2.9 Northern Blot探针标记
•     3.2.10 Northern Blot实验
•     3.2.11 sfRNA测序反应
•     3.2.12 小鼠实验
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 弱毒株WNVa减弱小鼠致病性及sfRNA产量
•     3.3.2 WNV病毒 3'UTR-10577 单个核苷酸的突变影响病毒致病性及sfRNA产生
•     3.3.3 WNV RCS3序列缺失影响sfRNA1的形成
•     3.3.4 WNV RCS3茎区结构（P4）是sfRNA1产生必需
•     3.3.5 WNV RCS3环区序列（L4）不影响sfRNA1产生
•     3.3.6 WNV CS3/RCS2/CS2是sfRNA2/3/4 产生必需
•     3.3.7 WNV CS3茎区结构是sfRNA2产生必需
•     3.3.8 ZIKV CS保守序列影响sfRNA产生
•     3.3.9 DENV2 CS保守序列影响sfRNA产生
•   3.4 讨论
• 第四章 总结与展望
•   4.1 总结
•   4.2 展望
• 参考文献
• 附录A 缩略词表
• 附录B 图表清单
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张秋艳

导师: 张波

关键词: 黄病毒,鄂木斯克出血热病毒,复制缺陷病毒,保守序列

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

基金: 国家重大传染病防治科技重大专项(2018ZX10734404-010),国家重点研发项目(2018YFA0507201)

分类号: R373

总页数: 130

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