日本七鳃鳗BCAP基因克隆、重组表达及相关免疫学研究

论文摘要

BCAP又名PI3KAP1（phosphoinositide-3-kinase adaptor protein 1）,BCAP含有四个YxxM基序。当B细胞受体（BCR）信号启动后,YxxM基序上的Tyr磷酸化可以募集到磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的P85α亚基并激活PI3K,活化的PI3K可以介导其下游激酶Akt磷酸化,进而入核调控基因的转录和表达,并最终参与调节B淋巴细胞的增殖,存活,代谢,细胞骨架重组与膜运输。七鳃鳗是具有很高研究价值的模式生物,因为它是在进化上联系脊椎动物和无脊椎动物的最原始的无颌类脊椎动物代表。在无颌类脊椎动物中是否存在BCAP以及功能如何尚无人报道。本研究在日本七鳃鳗（Lampetra japonica）中首次发现了BCAP基因,并采用嵌套PCR扩增技术用高保真酶对BCAP基因的cDNA进行了分子克隆。日本七鳃鳗BCAP分子（Lja-BCAP）开放阅读框的长度为2181bp,编码含有726个氨基酸残基的蛋白质。通过对不同脊椎动物BCAP的蛋白质序列进行比对分析发现,无颌类脊椎动物日本七鳃鳗原始类型的适应性免疫系统中也存在BCAP。为了更深入明确其进化关系,通过构建进化树发现,虽然与高等脊椎动物遗传距离较远,但BCAP在无颌类脊椎动物中已经进化出现。为了进一步了解Lja-BCAP在免疫调节中的作用,我们制备了Lja-BCAP兔源多克隆抗体。首先构建了pET-32a（+）-Lja-BCAP重组质粒,将重组质粒导入E.coli Rosetta表达菌诱导蛋白表达并进行了纯化,以纯化后的重组蛋白作为抗原免疫刺激新西兰兔（Oryctolagus cuniculus）制备兔源多克隆抗体,采用耳动脉取血的方式抽取血液制备抗血清,并将抗血清分离并纯化,得到了特异性较好的Lja-BCAP兔源多克隆抗体。利用siRNA干扰技术对Lja-BCAP分子的mRNA进行了体内干扰敲低实验。在核酸和蛋白水平上检测的结果表明:在注射了所设计的3组siRNA混合库以后又免疫刺激日本七鳃鳗单个核白细胞和髓样小体,Lja-BCAP分子的mRNA转录和蛋白翻译水平均能在随后的12-36h内被有效敲低。此结果为后续深入探索Lja-BCAP分子的功能奠定基础。通过反转录PCR和Western blot实验检测经PHA免疫处理后Lja-BCAP在mRNA转录水平和蛋白水平上的相对表达量,结果表明,在免疫处理前Lja-BCAP的mRNA在单个核白细胞、鳃组织和髓样小体中均有表达,并且在单个核白细胞中的表达量明显高于其它两个组织。Lja-BCAP在单个核白细胞中其mRNA水平和蛋白水平在PHA免疫处理后36h表达量呈现出显著的上调。这些数据表明,Lja-BCAP可能参与了日本七鳃鳗VLRB+淋巴细胞（类B细胞）的免疫应答过程,我们的研究结果为进一步研究BCAP分子在日本七鳃鳗淋巴细胞免疫应答过程中的作用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 BCAP分子的发现及其功能
•     1.1.1 BCAP分子结构特征
•     1.1.2 BCAP的免疫调节功能
•   1.2 BCAP对B细胞、NK及树突状细胞发育的影响
•     1.2.1 对B细胞发育的影响
•     1.2.2 对NK细胞发育的影响
•     1.2.3 对巨噬细胞发育的影响
•     1.2.4 对髓系祖细胞发育的影响
•   1.3 BCAP在TLR信号通路中的调节作用
•   1.4 BCAP在肿瘤诊疗中的应用前景
•     1.4.1 作为肿瘤发生的诊断依据
•     1.4.2 作为肿瘤发展检测的依据
•     1.4.3 作为肿瘤诊治的靶标的应用前景
•   1.5 小结
• 第2章 日本七鳃鳗BCAP基因的分子克隆及生物信息学的分析
•   2.1 Lja-BCAP基因ORF区的分子克隆
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验方法
•     2.1.3 结果
•     2.1.4 讨论
•     2.1.5 小结
•   2.2 日本七鳃鳗BCAP基因生物信息学的分析
•     2.2.1 生物信息学分析所用到的在线网站及软件
•     2.2.2 结果
•     2.2.3 讨论
•     2.2.4 小结
• 第3章 日本七鳃鳗BCAP蛋白原核表达及蛋白纯化
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 全长Lja-BCAP ORF区的引物设计
•     3.2.2 全长Lja-BCAP表达载体的构建
•     3.2.3 全长Lja-BCAP重组蛋白的鉴定及诱导
•     3.2.4 SDS-PAGE鉴定
•     3.2.5 截短Lja-BCAP抗原区段的表达载体构建
•     3.2.6 截短Lja-BCAP重组蛋白的纯化
•     3.2.7 截短Lja-BCAP重组蛋白浓度的测定
•   3.3 结果
•     3.3.1 全长p ET32a（+）-Lja-BCAP重组质粒的构建
•     3.3.2 全长Lja-BCAP重组蛋白的诱导表达
•     3.3.3 对全长Lja-BCAP截短突变为 600bp
•     3.3.4 截短Lja-BCAP重组蛋白的诱导表达
•     3.3.5 截短Lja-BCAP重组蛋白的可溶性鉴定及纯化
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第4章 七鳃鳗Lja-BCAP多克隆抗体制备及其鉴定
•   4.1 实验材料
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 免疫方法
•     4.2.2 Lja-BCAP多克隆抗体的纯化
•     4.2.3 Western blot法鉴定Lja-BCAP兔源多克隆抗体的特异性
•   4.3 结果
•     4.3.1 Lja-BCAP多克隆抗体的效价检测
•     4.3.2 鉴定Lja-BCAP多克隆抗体的特异性
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第5章 Lja-BCAP的si RNA敲低实验及在日本七鳃鳗体内免疫应答过程中的表达模式
•   5.1 实验材料
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 对日本七鳃鳗的m RNA进行敲减处理
•     5.2.2 日本七鳃鳗单个核白细胞的提取及各组织提取
•     5.2.3 反转录PCR法检测Lja-BCAP的m RNA经si RNA敲减后的表达
•     5.2.4 Western blot法检测Lja-BCAP蛋白经si RNA敲减后的表达
•     5.2.5 对日本七鳃鳗进行LPS、PHA免疫处理
•     5.2.6 反转录PCR法检测LPS、PHA免疫刺激后Lja-BCAP的m RNA的表达
•     5.2.7 Western blot法检测LPS、PHA免疫刺激后Lja-BCAP蛋白的表达
•   5.3 结果
•     5.3.1 Lja-BCAP的m RNA经si RNA敲减后在相关免疫组织中的表达模式
•     5.3.2 Lja-BCAP蛋白经si RNA敲减后在相关免疫组织中的表达模式
•     5.3.3 Lja-BCAP的m RNA经LPS、PHA免疫刺激后在相关免疫组织中的表达模式
•     5.3.4 Lja-BCAP蛋白经LPS、PHA免疫刺激后在相关免疫组织中的表达模式
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 结论
• 本论文的创新点
• 参考文献
• 附录A 不同物种的BCAP的FASTA格式氨基酸序列
• 附录B Pet32a（+）质粒图谱
• 附录C 日本七鳃鳗BCAP ORF区核酸序列
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郜迷层

导师: 刘欣

关键词: 日本七鳃鳗,分子克隆,抗体制备,免疫应答

来源: 辽宁师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 辽宁师范大学

基金: 辽宁省教育厅基本科研重点项目七鳃鳗NICER受体在VLR介导的类淋巴细胞免疫应答跨膜信号转导中的作用研究,(项目编号:LZ201783601)

分类号: Q78

总页数: 81

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