ACS5参与调节NaCl抑制种子萌发机制初探

论文摘要

种子萌发是植物生长发育最重要的阶段之一,它直接关系到植株是否能够正常进行生长发育。种子萌发受到环境因素和内部因素的影响,其中,高盐胁迫作为非生物胁迫之一能显著的抑制种子萌发,从而影响农作物产量。外援施加植物激素乙烯可以促进种子萌发,并可以缓解NaCl对种子萌发的抑制作用。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-Amino-1-cyclopropanecarboxylic acid,ACC）是乙烯合成的前体物质,它和NaCl通过调节COP1在细胞核中的积累,影响HY5蛋白的稳定和对ABI5的调控作用,从而调控种子萌发。但是在种子萌发过程中ACC含量也受到多种因素的影响,其机制以及对种子萌发产生怎样的影响目前还鲜有报道。ACS（ACC synthase）是ACC合成途径中的关键限速酶。拟南芥种ACS家族有12个成员,在植物生长发育过程中表现出时空特异性,其中ACS5在种子萌发阶段表达量最高,且能够受盐胁迫诱导,但具体ACS5与盐胁迫以及萌发之间的关系及机制还尚未知晓。本课题组前期研究发现,在盐胁迫条件下,突变体acs5-1种子萌发较WT提前,因此本课题主要探究ACS5如何参与NaCl抑制种子萌发过程。首先在拟南芥种质资源购得功能缺失型突变体acs5-1和acs5-2种子,并创制了ACS5回补株系(ACS5/acs5-1#1、ACS5/acs5-1#2)、超表达转基因株系（ACS5-OE）以及ProACS5::GUS转基因株系。在NaCl处理条件下,观察ACS5的组织化学定位,发现ACS5在种子萌发阶段有大量表达,且NaCl胁迫诱导ACS5在种子萌发前期大量积累。暗示ACS5参与NaCl抑制种子萌发过程。进一步观察表型发现:正常生长条件下,WT、acs5-1和acs5-2种子萌发时间无明显差别;但NaCl处理条件下,与WT相比,acs5-1、acs5-2和ACS5-OE萌发时间提前且萌发率升高,ACS5/acs5-1#1、ACS5/acs5-1#2与WT表现出的相同的表型,初步说明ACS5突变后缓解了NaCl对种子萌发的抑制作用。ACC的合成前体甲硫氨酸（Methionine,Met）和S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）的积累对种子萌发有正调控作用。检测萌发阶段的Met含量,发现acs5-1中Met和SAM的含量明显高于WT。推测这可能是盐胁迫下acs5突变体萌发较WT提前的原因之一。同时检测ACC含量,发现:与WT相比,在正常生长条件下,acs5-1中ACC含量无显著变化;但在NaCl处理条件下两天内,acs5-1中的ACC含量明显升高。为了探索ACC含量升高的原因,检测种子萌发时期,突变体acs5-1中在NaCl处理时其它ACS家族成员活性的变化,发现:在acs5-1萌发的第二天和第三天,能够与ACS5形成非活性二聚体的ACS2和ACS7转录水平较WT有显著升高。构建携带GFP标签的ACS2和ACS7载体都分别转入WT和acs5-1中,免疫印迹研究结果显示:在NaCl处理条件下,acs5-1萌发种子中ACS2和ACS7蛋白较WT中有明显积累。进一步杂交获得acs2-1 acs5-1双突变体,观察在NaCl处理条件下的表型发现,acs2-1 acs5-1双突变体的萌发时间较WT推迟明显且萌发率显著下降,说明:在种子萌发过程中,当acs5突变体中ACS2含量降低时,盐处理条件下,与WT相比,萌发时间会由原来的提前变为推迟。综上所述:NaCl处理条件下,acs5萌发较WT提前,原因可能有两个:一是acs5突变体中Met和SAM的积累高于WT;二是ACS5通过影响ACS2的mRNA水平和蛋白含量来影响acs5突变体中ACC含量,从而缓解NaCl对种子萌发的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词
• 1 前言
•   1.1 种子萌发过程及影响种子萌发因素
•     1.1.1 种子萌发过程
•     1.1.2 影响种子萌发的环境因素和内部因素
•   1.2 环境盐度影响种子萌发
•   1.3 植物激素乙烯参与调节种子萌发过程
•     1.3.1 乙烯的生物合成
•     1.3.2 ACS家族成员分类和表达情况
•     1.3.3 ACS家族成员主要以二聚体形式发挥作用
•     1.3.4 ACS2和ACS7 参与盐胁迫反应
•     1.3.5 乙烯和ACC促进种子萌发
•   1.4 ACS5 表达与ETO2 的关系
•   1.5 ACC生物合成前体物质Met和 SAM参与种子萌发过程
•   1.6 乙烯和ACC参与高盐抑制种子萌发过程
•   1.7 种子萌发过程中赤霉素与乙烯的关系
•   1.8 GA20ox调控活性GAs含量
•   1.9 立题依据
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验所用植物材料
•     2.1.2 实验所用菌种和载体
•   2.2 实验试剂
•     2.2.1 培养基
•     2.2.2 溶液配方
•     2.2.3 工具酶与试剂盒
•     2.2.4 蛋白相关试剂配制方法
•   2.3 实验引物
•     2.3.2 PCR引物序列
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 拟南芥种植
•     2.4.2 侵染与筛选转基因植株
•     2.4.3 NaCl及 ACC处理
•     2.4.4 种子萌发表型分析
•     2.4.5 拟南芥基因组DNA提取
•     2.4.6 拟南芥总RNA提取及c DNA制备
•     2.4.7 制备大肠杆菌感受态细胞及转化过程
•     2.4.8 制备农杆菌感受态细胞与转化过程
•     2.4.9 载体构建
•     2.4.10 植物组织GUS化学染色
•     2.4.11 拟南芥ACC提取与测定
•     2.4.12 Met和 SAM含量检测
• +、K⁺、Ca²⁺含量检测'>    2.4.13 Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量检测
•     2.4.14 蛋白提取及免疫印迹实验
• 3 结果与分析
•   3.1 获得ACS5 相关表达材料
•     3.1.1 鉴定T-DNA插入突变体acs5-1和acs5-2 纯合株系
•     3.1.2 转ACS5 基因材料的创制与鉴定
•   3.2 ACS5 参与NaCl抑制种子萌发过程
•     3.2.1 ACS5 在植株生长发育前期表达
•     3.2.2 NaCl处理对acs5 种子萌发时间的影响
•   3.3 NaCl处理对acs5-1 萌发种子中Na+含量的影响
•   3.4 萌发的acs5-1 种子中Met和 SAM含量
•   3.5 萌发的acs5-1 种子中ACC含量升高
•   3.6 萌发的acs5-1 种子中ACS2和ACS7 转录水平显著升高
•   3.7 NaCl处理对acs5-1 萌发种子中ACS2和ACS7 蛋白积累的影响
•   3.8 NaCl处理对双突变体acs2-1 acs5-1 萌发的影响
•   3.9 萌发的acs5-1 种子中GA20 氧化酶活性变化
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李冠军

导师: 江静

关键词: 种子萌发,盐胁迫

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河南大学

分类号: Q945.34

总页数: 63

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