双峰驼肠道微生态特征及纤维素分解菌的研究

论文摘要

双峰驼栖息于干旱的荒漠和半荒漠地区,被誉为“沙漠之舟”的双峰驼经过长期的自然选择,形成了解毒、耐饥渴、耐干旱等能力。双峰驼喜食高盐或具有一定毒性的食物,其消化系统不同于其他的反刍动物,前胃仅有瘤胃、网胃、皱胃三室,没有瓣胃组成。动物胃肠道中存在大量的微生物群落,构成了动物消化道的微生物区系,这些微生物群落与动物的食性、机体免疫、营养需求等密切相关。但是,目前针对骆驼独特的肠道微生物的相关报道较少。因此,本研究首先对双峰驼胃肠道微生物的进行16r DNA测序,研究了双峰驼胃肠道不同区段和不同年龄细菌群落组成的动态变化情况,掌握其多样性变化规律,并揭示其中的优势物种。其次,对粪便样品开展全宏基因组鸟枪法测序研究,从DNA水平更全面的展示整个群落的组成和微生物降解纤维素的能力。在此基础上,以双峰驼的粪便样本为研究对象,分离和筛选高效降解纤维素的细菌并研究其产纤维素酶的特性,为挖掘骆驼源纤维素酶源提供一定的理论依据。本研究表明双峰驼肠道微生物组是一种密集且尚未开发的酶的来源,在食品加工行业或动物饲料行业中具有巨大的应用潜力。主要研究结果如下:（1）基于扩增子测序的双峰驼胃肠道小同区段的微生物多样性分析基于16S rDNA高变区V4测序,分析了来自11峰成年双峰驼8个区段瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和粪便样本的99个样本的菌群多样性。该研究共发现27个门,其中厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）门是整个双峰驼胃肠道中的优势菌群,广泛存在于双峰驼胃肠道。但胃肠道不同区段间微生物群落组成仍存在显著的空间特异性。特别是,在大肠和粪便样品中发现了相对丰度较高的阿克曼菌属（Akkermasia）和未分类的胃瘤菌科（Ruminococcaceae）,而在胃和小肠中存在更多未分类的梭菌科（Clostridiales）和未分类拟杆菌科（Unclassified Bacteroidales）。通过相似性分析发现,大肠中的微生物与粪便中的微生物具有较高相似性,但与胃中微生物群落的相似性较低。基于微生物群落代谢功能预测,发现胃中富集到高比例的与代谢疾病有关的功能,十二指肠和空肠含有较高比例的与癌症和传染的功能。这些结果为了解双峰驼的胃肠道微生物群落特征提供了一定的理论依据。（2）基于扩增子测序的双峰驼不同年龄肠道微生物多样性分析基于16S rDNA基因高通量测序技术对不同年龄的双峰驼粪便微生物群落进行分析。研究表明:随着年龄的增长,微生物群的多样性不断增加,并且在1岁大时双峰驼肠道中微生物的组成也趋于稳定状态。在门水平,2个月大幼驼主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）组成。但是,1岁和3岁双峰驼由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）门为主导。在属的水平上,ChristensenellaceaeR-7group 属,RuminococcaceaeUCG-005属,阿克曼菌属（Akkermansia）是1岁和3岁双峰驼肠道内的优势菌群。但是布劳特氏菌属（Blautia）,梭杆菌属（Fusobacterium）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）在 2个月大的幼驼中更加丰富,并在此阶段2个月大幼驼肠道内也侵入大量的埃希氏菌/志贺氏菌属（Eschericha-Shigella）。基于微生物群落代谢功能预测,2个月大的幼驼肠道中与免疫系统疾病相关的功能富集程度较高。该研究首次对不同年龄的双峰驼肠道微生物群的分布进行研究,为今后深入了解双峰驼的肠道特征提供了一定的科学依据。（3）基于宏基因组测序的双峰驼粪便微生物组成和功能研究本研究分别采集3峰野生和8峰家养双峰驼粪便样品进行测序,对双峰驼粪便微生物宏基因组进行组成和功能注释。结果表明:双峰驼肠道中细菌占93.73%,古生菌占0.8%,真菌占0.4%。针对CAZy数据库对所测序列进行分析发现,肠道中38.3%为编码糖苷水解酶,26.3%为编码糖基转移酶,13.3%为编码碳水化合物酯酶,12.5%为编码碳水化合物结合模块,4.5%为编码辅助氧化还原酶,2.8%为多糖裂解酶。此次研究共被富集到126个不同的糖苷水解酶家族,GH2,GH3,GH5,GH13相对丰度最丰富的酶类。其中,内切葡聚糖酶,内切纤维素酶,脱支酶和寡糖降解酶是家养和野生双峰驼肠道内最主要的纤维素降解酶。梭菌属（Clostridium）,瘤胃球菌属（Ruminococcus）拟杆菌属（Bacteroides）,粪杆菌属（Faecalibacterium）,类芽孢杆菌属（Paenibacillus）在家养和野生双峰驼肠道消化纤维中发挥着关键作用。基于碳水化合物注释显示,家养和野生双峰驼碳水化合物酶类注释具有较高相似性,但与其他反刍动物存在一定差异。该研究为深入挖掘双峰驼肠道微生物资源奠定科学依据,为开发骆驼源的纤维素酶类提供一定理论基础。（4）双峰驼粪便中纤维素分解菌的分离鉴定及产酶特性研究采用羧甲基纤维素平板法初筛和摇瓶发酵法复筛,从双峰驼粪便中分离筛选出1株能够高效降解纤维素的细菌:采用形态学、生理生化特性以及16S rDNA序列的同源性分析,基于其所产CMCase酶反应的碳源、氮源、pH、温度、时间和接种量来评价该菌株的酶学特性。结果表明:初步鉴定该菌株为Cellulosimicrobium cellulans strain。该酶在50℃,pH为6.0时酶活力最佳,且具有较好的热稳定性。该菌株液体发酵的最佳氮源是酵母提取物,最佳碳源是麦芽糖,最佳接种量10%,最适初始pH 7.0,最适温度30℃,最适发酵时间72h。所筛选菌株所产生的酶具有一定的耐碱性和耐热性,可将其应用于食品行业或废料处理等方面。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 引言
•   1.1 研究背景
•   1.2 骆驼独特生物学特性和胃肠道研究进展
•     1.2.1 骆驼独特的生物学特性
•     1.2.2 骆驼胃肠道细菌多样性及其功能
•   1.3 纤维素分解菌和纤维素酶的研究进展
•     1.3.1 纤维素分解菌的来源和分离
•     1.3.2 纤维素降解作用机制
•     1.3.3 纤维素酶的应用
•   1.4 肠道微生物在哺乳动物体内的作用研究进展
•     1.4.1 揭示微生物对动物营养与消化作用
•     1.4.2 揭示益生菌对机体生长与发育作用
•     1.4.3 揭示肠道微生物对人体健康的作用
•     1.4.4 揭示粪便移植在人体肠道中的作用
•   1.5 肠道微生物研究的常见的生物技术概况
•     1.5.1 宏基因组学技术
•     1.5.2 其他组学技术
•   1.6 本研究立题意义和内容
•     1.6.1 立题意义
•     1.6.2 研究内容
• 2 基于扩增子测序的双峰驼不同区段胃肠道微生物多样性分析
•   2.1 前言
•   2.2 试验材料
•     2.2.1 试验动物样品采集
•     2.2.2 试验仪器和耗材
•   2.3 试验方法
•     2.3.1 内容物肠道微生物基因组DNA提取和16S rDNA测序
•     2.3.2 16S rDNA测序数据分析方法
•     2.3.3 RT-PCR验证不同区段胃肠道细菌
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 双峰驼物种的丰度和多样性分析
•     2.4.2 双峰驼胃肠道微生物群落结构组成分析
•     2.4.3 双峰驼胃肠道菌群结构特征
•     2.4.4 RT-PCR检测胃肠道细菌菌落
•     2.4.5 微生物群落代谢功能预测
•   2.5 讨论
•   2.6 本章小结
• 3 基于扩增子测序的双峰驼不同年龄肠道微生物多样性分析
•   3.1 前言
•   3.2 试验材料
•     3.2.1 试验动物样品采集
•     3.2.2 试验仪器和耗材
•   3.3 试验方法
•     3.3.1 粪便内容物微生物基因组DNA提取和16S rRNA测序
•     3.3.2 16S rDNA测序数据分析方法
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 物种的丰度和多样性分析
•     3.4.2 肠道微生物群落结构组成和比较分析
•     3.4.3 肠道优势微生物类群的分析
•     3.4.4 微生物群落代谢功能预测
•   3.5 讨论
•   3.6 本章小结
• 4 基于宏基因组测序的双峰驼粪便微生物组成和功能的研究
•   4.1 前言
•   4.2 试验材料
•     4.2.1 试验动物样品采集
•     4.2.2 试验仪器和耗材
•   4.3 试验方法
•     4.3.1 粪便内容物微生物基因组DNA提取和全宏基因组鸟枪法测序
•     4.3.2 全宏基因组鸟枪法测序数据分析
•   4.4 结果与分析
•     4.4.1 测序数据的整理统计
•     4.4.2 双峰驼肠道微生物物种组成
•     4.4.3 双峰驼肠道微生物EggNOG注释
•     4.4.4 双峰驼肠道微生物KEGG注释
•     4.4.5 双峰驼粪便肠道微生物碳水化合物酶类注释
•     4.4.6 双峰驼肠道内编码碳水化合物酶的微生物群落分析
•   4.5 讨论
•   4.6 本章小结
• 5 双峰驼粪便中纤维素分解菌的分离鉴定及产酶特性研究
•   5.1 前言
•   5.2 试验材料
•     5.2.1 样品采集
•     5.2.2 主要试剂
•     5.2.3 主要仪器设备
•     5.2.4 主要培养基的配制
•     5.2.5 主要试剂配制
•   5.3 试验方法
•     5.3.1 纤维素分解菌的筛选
•     5.3.2 酶活测定
•     5.3.3 纤维素降解菌的鉴定
•     5.3.4 CMCase的酶学性质的研究
•     5.3.5 不同发酵条件AT9-6产酶条件优化
•   5.4 结果与分析
•     5.4.1 纤维素分解菌的分离
•     5.4.2 菌株生理生化和分子生物学鉴定
•     5.4.3 AT9-6菌株粗酶活性的测定
•     5.4.4 菌株AT9-6的CMCase的初步优化
•   5.5 讨论
•   5.6 本章小结
• 6 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 创新点
•   6.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 何静

导师: 吉日木图

关键词: 双峰驼,宏基因组,肠道微生物,纤维素分解菌,酶学特性

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: Q93

总页数: 133

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