猪流感病毒（H3N2）NP蛋白纳米抗体的制备及阻断ELISA方法的建立与评价

论文摘要

猪流感是一种由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的猪的急性呼吸道疾病,其主要临床特征是发热、嗜睡、厌食症和鼻塞,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪流感病毒主要包括H1N1,H1N2和H3N2三个亚型。猪一旦感染,会迅速发病,且常与其他呼吸道病原体混合感染。目前,猪流感血清学诊断方法主要包括血凝抑制试验和ELISA,虽然血凝抑制试验是猪流感血清学诊断的标准方法,但该方法结果的判定存在主观性,而且不适宜大规模样品的检测。传统ELISA方法主要是基于多克隆抗体和单克隆抗体而建立的,但单克隆抗体的制备费时费力,且生产成本高,多克隆抗体存在特异性低的问题。纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势,并且可通过不同的表达系统获得,是一种良好的诊断和治疗工具。本研究应用原核表达系统表达SIV高度保守的核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）,并通过噬菌体展示技术筛选NP蛋白特异性纳米抗体,纳米抗体与生物素受体肽融合表达和纯化后,通过生物素受体肽与生物素的结合标记生物素,用生物素化的纳米抗体作为阻断抗体,建立了一种特异的,敏感的和重复性好的检测猪血清中流感抗体的阻断ELISA方法,主要结果如下:1:SIV-NP蛋白的表达和纯化将pET-32a-NP重组质粒转化至Rosetta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,获得可溶性表达的NP蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化后,与弗氏佐剂混合用于双峰驼的免疫。2:SIV-NP蛋白特异性纳米抗体的筛选第5次免疫后一周,采集双峰驼外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,通过巢式PCR扩增VHH基因,将VHH基因克隆至噬菌体载体pCANTAB 5E,并通过噬菌体展示技术淘选NP蛋白特异性的纳米抗体,三轮淘选后得到6株纳米抗体,亲和力验证试验结果表明,Nb5具有较高的亲和力。3:纳米抗体的生物素化在Nb5氨基酸序列的C端连接生物素受体肽（biotin acceptor peptide,BAP）,将基因序列克隆至pET-21b原核表达载体,并转化至E.coli BL21（DE3）IPTG诱导表达后得到以包涵体形式表达的Nb5-BAP融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化后进行透析,通过生物素标记试剂盒在体外将生物素标记在Nb5的C端受体肽上,标记完成后通过间接ELISA测得效价可达1:100000以上。4:阻断ELISA方法的建立与评价通过棋盘滴定ELISA确定最佳的抗原包被量为1μg/mL,1 mg/mL纳米抗体的最佳稀释比例为1:30000,血清的最佳稀释比例为1:10,同时用109份猪的阴性血清确定Cut-off值为29.8%,建立的阻断ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,而且与商品化试剂盒和Western blot具有较高的一致性。综上所述,本研究筛选到了SIV-NP蛋白特异性纳米抗体,其中用纳米抗体生物素化的Nb5作为阻断抗体,建立了一种检测猪血清中流感抗体的阻断ELISA方法,可用于检测猪血清中流感病毒抗体水平和评价疫苗免疫效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 猪流感病毒的研究进展
•     1.1.1 猪流感病毒的分类及特性
•     1.1.2 猪流感临床症状及病理变化
•     1.1.3 流感病毒传播及猪在传播中扮演的角色
•     1.1.4 猪流感的诊断方法
•     1.1.5 疫苗接种
•   1.2 纳米抗体研究内容概况
•     1.2.1 常规抗体及重链抗体的结构组成
•     1.2.2 纳米抗体的结构特征
•     1.2.3 纳米抗体的特性
•     1.2.4 纳米抗体的应用
• 第二章 猪流感病毒NP蛋白的表达与纯化
•   2.1 材料
•     2.1.1 质粒以及菌株
•     2.1.2 主要设备和仪器
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要试剂的配制
•   2.2 NP蛋白原核表达和可溶性分析
•     2.2.1 pET-32a-NP重组蛋白的诱导表达
•     2.2.2 SDS-PAGE分析重组蛋白
•     2.2.3 Western印迹检测重组蛋白
•     2.2.4 NP重组蛋白的纯化
•     2.2.5 蛋白浓度测定
•   2.3 试验结果
•     2.3.1 SIV-NP重组蛋白的表达与纯化
•     2.3.2 SIV-NP重组蛋白的鉴定
•   2.4 讨论
• 第三章 SIV-NP蛋白特异性纳米抗体的筛选及生物素标记
•   3.1 试验材料与仪器设备
•     3.1.1 质粒、菌株及实验动物
•     3.1.2 主要试剂耗材2
•     3.1.3 主要仪器设备
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 实验动物免疫
•     3.2.2 构建VHH噬菌体文库
•     3.2.3 淘选NP特异性纳米抗体
•     3.2.4 NP特异性纳米抗体的鉴定
•     3.2.5 pET-21b-Nb5-BAP原核表达载体的构建
•     3.2.6 Nb5原核表达和可溶性分析
•     3.2.7 生物素标记纳米抗体
•     3.2.8 间接ELISA测定标记抗体效价
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 SIV-NP重组蛋白特异性抗体效价的测定
•     3.3.2 噬菌体展示文库的构建及文库阳性率检测
•     3.3.3 SIV-NP重组蛋白特异性纳米抗体的淘选
•     3.3.4 SIV-NP特异性纳米抗体鉴定
•     3.3.5 SIV-NP蛋白纳米抗体的特异性及效价检测
•     3.3.6 Nb5-生物素受体肽融合蛋白的表达与纯化
•     3.3.7 间接ELISA检测生物素化Nb5的效价
•   3.4 讨论
• 第四章 SIV纳米抗体抗体阻断ELISA检测方法的建立
•   4.1 材料与仪器设备
•     4.1.1 材料
•     4.1.2 仪器设备
•   4.2 方法
•     4.2.1 基于纳米抗体的阻断ELISA方法的建立
•     4.2.2 阻断ELISA方法的评价
•   4.3 结果
•     4.3.1 抗原最佳包被浓度与抗体最佳工作浓度的确定
•     4.3.2 最佳血清稀释度的确定
•     4.3.3 阻断ELISA方法Cut-off值的确定
•     4.3.4 特异性评价
•     4.3.5 敏感性评价
•     4.3.6 阻断ELISA的重复性评价
•     4.3.7 阻断ELISA的一致性比较
•   4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱光

导师: 周恩民,杜涛峰

关键词: 猪流感病毒,纳米抗体,阻断

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家重点研发计划(2016YFD0500706,2017YFD0501006)

分类号: S852.4

总页数: 62

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