基于次生代谢产物代谢途径调控海洋微生物产生纤溶活性化合物的研究

论文摘要

海洋微生物处于高压、高盐、低溶氧、低营养和少光的极端环境,也导致生长繁殖和次生代谢的独特性,能产生结构新颖和生物活性多样性的次生代谢产物,具有抗肿瘤、神经保护、抗真菌、抗氧化、抗动脉硬化、抗病毒、抗炎活性。调控微生物次生代谢被认为能显著提高目标化合物的产量并可能产生新型化合物,发现新型小分子纤溶活性化合物,有可能在血栓新药研发方面取得突破性进展。指导新颖化合物的探索。本实验通过调控海洋长孢葡萄穗霉菌的次生代谢途径影响次生代谢产物的产生,优化发酵条件和方法,通过液相分析色谱解析次生代谢产物的产出情况,确定合适的次生代谢调控物质,通过液相制备色谱分离纯化出目标产物,解析化合物的分子结构及其促纤溶活性的作用特性。长孢葡萄穗霉菌FG216培养条件的优化。取出保存于-80℃冰箱中的海洋长孢葡萄穗霉菌FG216,菌株经过种子培养基活化,查氏液体培养基发酵。以次生代谢产物丰富度为主要指标和参考菌体质量,通过改变发酵温度、碳源的补充以及添加前体物进行优化。在28℃发酵温度条件下,菌株菌体质量在发酵第3天达到稳定期,第10 d进入衰亡期,次生代谢产物的丰富度在第六天达到最大。通过在发酵过程中添加蔗糖,分析次生代谢产物的产出情况判定FG216在发酵过程中不需要再进行碳源的补充。在发酵培养基中,补充前体物L-鸟氨酸盐酸盐后,次生代谢产物量提高了1.90倍。确定长孢葡萄穗霉菌FG216的规模发酵条件为查氏液体培养基,接种量为5%,28℃,180 r/min,活化培养3天,发酵培养7天。优化了长孢葡萄穗霉菌FG216的培养与发酵条件。次生代谢调控物质的发现。查氏液体培养基发酵FG216菌株7天,取5 mL发酵液经过甲醇提取处理,真空干燥,得到甲醇粗提物。2 mL甲醇复溶后离心过滤膜用液相分析色谱次生代谢产物。与添加了鸟氨酸的对照组相比,次生代谢调控物质为色氨酸或苯丙氨酸时检测出新的保留峰,确定色氨酸或苯丙氨酸调控了长孢葡萄穗霉菌次生代谢途径从而影响了次生代谢产物的产生。长孢葡萄穗霉菌FG216的次生代谢产物的分离纯化与结构解析。通过规模发酵培养添加了鸟氨酸、色氨酸、苯丙氨酸的的FG216的菌株各得到1L发酵液,经甲醇提取后得到粗样品分别为70 mg,880 mg、18 mg、60 mg,复溶与甲醇中至浓度为24 mg/mL,44 mg/mL、3 mg/mL、20 mg/mL。通过液相制备色谱对甲醇提取物进行分离纯化,高分辨质谱及核磁共振波谱技术对化合物进行结构解析。新型小分子化合物的纤溶活性。以纤溶活性小分子化合物FGFC1为阳性对照,通过模拟人体溶栓体系尿激酶前体（single chain urokinase-type plasminogen activator,pro-uPA）与纤溶酶原（Glu1-plasminogen,Plg）对单体小分子化合物进行了体外纤溶生理活性的评价。结果显示化合物FGFCD能够促进pro-uPA/Plg体系降解纤维蛋白的纤溶作用,分离得到的化合物FGFCA,FGFCB、FGFCC促纤溶活性均低于对照FGFC1。在代谢过程中添加ADP、柠檬酸三钠、赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺,与对照组鸟氨酸相比未发现新的保留峰,即无新化合物生成。所得到的4种新的化合物中,FGFCB和FGFCD显示出良好的纤溶活性,FGFCA、FGFCC、FGFCE均未显示出较好的纤溶活性。根据保留时间对化合物进行极性从大到小排序,FGFCA>FGFCC>FGFCB>FGFCD>FGFC1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 双吲哚化合物的生物合成途径和生物活性
•   1.1 吲哚的生物合成途径
•     1.1.1 来自色氨酸的双吲哚的生物合成途径
•     1.1.2 来自乙酰CoA的异吲哚的生物合成途径
•   1.2 海洋中双吲哚类生物碱
•     1.2.1 海洋中双吲哚类生物碱的结构
•     1.2.2 海洋中双吲哚类生物碱的活性
•   1.3 总结
• 第二章 菌株的培养和活性筛选
•   2.1 实验材料与仪器
•     2.1.1 实验菌株
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 实验试剂
•     2.1.4 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 种子液的制备
•     2.2.2 菌株的发酵培养
•     2.2.3 菌株待测样品的制备
•     2.2.4 FG216 生长过程中代谢调控方法
•     2.2.5 FG216 代谢产物的高效液相色谱条件分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 碳源对海洋长孢葡萄穗霉菌FG216 代谢产物的影响
•     2.3.2 海洋长孢葡萄穗霉菌FG216 产生纤溶活性化合物FGFC1
•   2.4 结论
• 第三章 葡萄长孢穗霉菌FG216 代谢产物分离纯化与结构解析
•   3.1 实验材料与仪器
•     3.1.1 培养基
•     3.1.2 实验试剂与材料
•     3.1.3 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 葡萄长孢穗霉菌FG216 的一般发酵方法
•     3.2.2 葡萄长孢穗霉菌FG216 代谢调控
•     3.2.3 葡萄长孢穗霉菌FG216 扩大培养
•     3.2.4 菌株次生代谢产物的提取
•     3.2.5 菌株次生代谢产物的分离纯化
•     3.2.6 单体化合物的结构解析
•       3.2.6.1 质谱分析
•       3.2.6.2 核磁共振分析
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 菌株形态学特征
•     3.3.2 代谢调控对菌株生长的影响
•       3.3.2.1 苯丙氨酸影响FG216 次生代谢产物的产生
•       3.3.2.2 色氨酸影响FG216 代谢产物的产生
•       3.3.2.3 其余五种次生代谢调控物质对FG216 代谢产物产生的影响
•     3.3.3 次生代谢产物的分离纯化
•     3.3.4 .不同化合物的UV特征光谱分析
•     3.3.5 化合物的结构鉴定
•   3.4 结论
• 第四章 葡萄长孢穗霉菌FG216 代谢产物的纤溶活性评价
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验试剂与仪器
•     4.1.2 单体化合物体外评价方法
•   4.2 结果与讨论
•     4.2.1 单体化合物的纤溶活性体外评价
•   4.3 结论
• 第五章 全文总结与展望
•   5.1 全文总结
•   5.2 后期研究与展望
• 参考文献
• 附录
•   附录一 单体化合物核磁共振图谱

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 钱士云

导师: 吴文惠,郭锐华

关键词: 纤溶作用,先导化合物,分离纯化,结构解析,长孢葡萄穗霉菌

来源: 上海海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,有机化工

单位: 上海海洋大学

分类号: TQ28;Q939.9

DOI: 10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000551

总页数: 61

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