导读:本文包含了原代鸭肝细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:肝细胞,细胞,内质网,胶原酶,利福平,脐带,胰岛素。
原代鸭肝细胞论文文献综述
覃媛钰,罗华伦,吴磊,张依裕[1]（2019）在《鸭CD36基因表达载体构建及其对原代肝细胞和PC3细胞脂质性状的影响》一文中研究指出脂肪酸转位酶(CD36)具有广泛的生物学功能,能够促进长链脂肪酸转入脂肪细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞,对细胞脂质代谢有重要调控作用。为探究CD36对鸭原代肝细胞和PC3细胞脂质效应,本试验采用Ⅳ型胶原酶消化法成功分离孵化了21日龄鸭胚原代肝细胞并进行培养,RT-PCR法获取鸭CD36基因序列,构建了携带HIS标签的pEGFP-N3-CD36真核表达载体pEGFP-N3-CD36-His,脂质体法转染至鸭胚原代肝细胞和PC3细胞,His标签检测试剂盒测定CD36在2种细胞中的过表达量,探讨鸭CD36基因过表达与原代肝细胞和PC3细胞中脂质性状的关联性。结果显示,pEGFP-N3-CD36-His重组质粒在鸭原代肝细胞和PC3细胞中均能发出绿色荧光,说明构建的载体转染成功;CD36过表达对2种细胞中脂质指标的影响相似,均与细胞中的甘油叁酯(TG)呈极显着正相关(P<0.01),与总胆固醇(TCH)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)呈极显着负相关(P<0.01);揭示CD36基因过表达可能引起2种细胞中脂质代谢活动的不平衡而引起脂质代谢相关疾病的发生,为进一步研究CD36基因对细胞脂质代谢的调控奠定了基础。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2019年10期）
图门吉日嘎勒,魏成喜,霍万学,张冬丽,包琳[2]（2019）在《蒙药古古勒-4味汤对原代肝细胞氧化应激损伤的保护作用及机制》一文中研究指出目的:研究古古勒-4味汤(黑云香四味汤散)对H_2O_2所致的原代肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制.方法:取新生乳鼠肝脏,加入0.1%Ⅱ型胶原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液分离培养原代肝细胞,加入不同剂量(100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L) H_2O_2建立原代肝细胞氧化应激损伤模型.原代肝细胞氧化应激损伤模型建立成功后,加入0.5 mg/mL、1 mg/mL及1.5 mg/mL古古勒-4味汤确定古古勒-4味汤最佳剂量.MTT检测H_2O_2和古古勒-4味汤最佳剂量及肝细胞活性;收集细胞,采用ELISA检测不同组细胞中GSHPx和SOD的表达情况;采用real-time PCR法检测各组肝细胞Nrf2、Keap1的mRNA表达情况.结果:对数生长期的原代肝细胞加入终浓度为200μmol/L H_2O_2培养6个小时后,给予1mg/mL古古勒-4味汤处理肝细胞后,肝细胞活力较模型组明显上升;古古勒-4味汤处理后,细胞中SOD、GSH-Px活性增强;古古勒-4味汤处理后,肝细胞活性氧明显降低;古古勒-4味汤处理后,肝细胞Nrf2、Keap1的mRNA水平下调.结论:古古勒-4味汤通过影响Keap1-Nrf2/ARE信号通路,保护由H_2O_2所致的原代肝细胞氧化应激损伤.(本文来源于《内蒙古民族大学学报(自然科学版)》期刊2019年04期）
吴源泉,吴建华,王梁,林洋[3]（2019）在《脐带间充质干细胞通过旁分泌机制维持原代小鼠肝细胞的体外生长》一文中研究指出背景:肝细胞移植对于晚期肝功能衰竭患者是一种非常有效的替代治疗方法,体外条件下扩增培养肝细胞具有非常重要的临床意义。目的:体外实验探讨人脐带间充质干细胞对原代小鼠肝细胞功能的调控作用。方法:实验分3组:①人脐带间充质干细胞与原代小鼠肝细胞非接触共培养(非接触共培养组);②人脐带间充质干细胞培养液上清与原代小鼠肝细胞共培养(上清组);③原代小鼠肝细胞用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养(常规培养组)。培养48,72,96 h,采用MTT法检测3组肝细胞增殖情况,吲哚菁绿检测肝细胞相关功能,ELISA法检测白蛋白及尿素分泌情况,RT-PCR检测肝细胞相关基因表达。该研究的实施符合喀什地区第一人民医院的相关伦理要求(伦理批件号:01号)。结果与结论:①与常规培养组相比,培养48,72,96 h时非接触共培养组和上清组都可以显着促进小鼠肝细胞增殖,差异有显着性意义(P <0.05);②与常规培养组相比,培养96 h时非接触共培养组和上清组都可以维持小鼠肝细胞的摄取功能活性,差异有显着性意义(P <0.05);③与常规培养组相比,在48 h和96 h时非接触共培养组和上清组小鼠肝细胞分泌白蛋白及尿素水平显着升高,差异有显着性意义(P <0.05);④与常规培养组相比,非接触共培养组和上清组HGF、b FGF以及ALB mRNA表达显着升高,差异有显着性意义(P <0.05);但细胞色素基因CYP2B9的表达在3组细胞内差异无显着性意义(P> 0.05);⑤结果表明,脐带间充质干细胞可通过旁分泌机制在体外维持原代小鼠肝细胞功能,并促进其增殖,是体外条件下人工扩增肝细胞的一种新的应用策略。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2019年25期）
刘蕾,杨玉洁,王凌,蒋学华[4]（2019）在《在“叁明治”培养大鼠原代肝细胞中研究利福平及联用丹参酮ⅡA对普伐他汀经BSEP转运的影响》一文中研究指出目的以普伐他汀为BSEP底物,在"叁明治"培养大鼠原代肝细胞模型上(sandwich-cultured rat hepatocytes,SCRH),研究利福平及联用丹参酮ⅡA对BSEP转运能力的影响。方法构建SCRH模型,利用MTT筛选给药剂量;建立普伐他汀的HPLC-MS/MS检测方法并进行方法学验证;考察利福平及联用丹参酮ⅡA对胆管内普伐他汀浓度的影响,并计算胆管外排指数(biliary excretion index,BEI)。结果成功构建了SCRH模型,并确定了利福平、丹参酮ⅡA、格列本脲及普伐他汀的合适给药剂量;建立了稳定可靠的普伐他汀HPLC-MS/MS检测方法;与空白组相比,利福平能够降低胆管内普伐他汀的浓度和普伐他汀的BEI,高浓度利福平的降低效果最明显(P <0. 01);与利福平高浓度组相比,联用丹参酮ⅡA后,胆管中普伐他汀的浓度以及普伐他汀的BEI增大,高浓度丹参酮ⅡA的增加效果最明显(P <0. 01)。结论在SCRH中,利福平能够抑制BSEP的转运能力,丹参酮ⅡA可以逆转利福平对BSEP转运能力的抑制作用。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2019年07期）
刘润琪[5]（2019）在《不同脂肪酸对犊牛原代肝细胞脂质沉积及肝损伤特征的研究》一文中研究指出奶牛围产期是指从分娩前3周到分娩后3周,是营养代谢病的高发期。研究表明,奶牛产后对能量的需求约是产前的2倍,而与此同时由于分娩后奶牛体况、代谢和激素分泌的改变导致奶牛干物质摄入下降使奶牛处于能量负平衡(NEB)状态。为了满足泌乳初期的能量需求,机体动员妊娠期脂肪组织储备的能量。脂肪动员的结果导致血液循环中非酯化脂肪酸(NEFA)浓度急剧升高。能量负平衡下当大量的NEFA进入肝脏时由于不能被完全氧化以及再酯化生产大量甘油叁酯,将会引起酮病、脂肪肝发生,并导致肝功能受损。在能量负平衡状况下围产期奶牛血液中高NEFA导致的肝细胞严重的氧化应激已被证实,而奶牛血液中的不同脂肪酸对肝脏的损伤特征尚不明确。故本研究拟通过明确健康奶牛和能量负平衡奶牛血清和乳中脂肪酸的分布特征,筛选出健康奶牛和能量负平衡奶牛含量最高的脂肪酸,探讨不同脂肪酸对原代犊牛肝细胞内质网应激、氧化应激和脂肪从头合成的影响,进而阐明不同脂肪酸介导的肝细胞损伤特征。本研究跟踪采集奶牛产前7 d,产后3 d、7 d、14 d、21 d血液及产后3 d、7 d、14 d、21d乳汁样品,依据产后任意采样点血液中的NEFA、BHBA的水平,将其分为对照组(C组,n=5,NEFA<0.4 mmol/L,BHBA<0.5 mmol/L)和能量负平衡组(K组,n=5,BHBA>1.2 mmol/L,NEFA>0.4 mmol/L),利用气相质谱联用技术分析两组奶牛血液及乳液样品脂肪酸的分布特征。结果显示,血清中检测到16种脂肪酸,两组中C16:0、C18:0、C18:1n9、C18:2n6的含量较高;跟踪期间K组奶牛血液C18:0和C18:1n9水平呈显着高于C组,C20:0和C22:1n9水平显着低于C组,而两组奶牛血液C16:0水平无显着差异。乳汁样品检测到20种脂肪酸,其中C16:0、C18:0、C18:1n9、C14:0、C16:1n7、C18:2n6含量较高。K组奶牛乳汁C18:1n9c水平显着高于C组,C14:0、C18:2n6水平显着低于C组,而两组间C16:0、C16:1n7、C18:1n9水平差异不显着。本研究最终选择了C16:0(棕榈酸,PA)、C16:1n7(棕榈油酸,POA)、C18:0(硬脂酸,SA)、C18:1n9(油酸,OA)、C18:2n6(亚油酸,LA)作为研究单一脂肪酸对能量负平衡奶牛的影响的脂肪酸。为筛选脂肪酸良性溶剂,本研究将OA溶于H_2O、0.1 mol/L KOH、乙醇、PBS、BSA(0.4%、0.8%和1.2%)和DMSO(0.1%、0.4%和0.8%),应用MTT法检测细胞活性,试剂盒检测对细胞甘油叁酯(TG)和总胆固醇(TC),采用荧光染色检测细胞活性氧(ROS)水平,荧光定量PCR检测内质网应激标志物GRP78mRNA水平。结果显示,KOH组、乙醇组诱导的肝细胞TG及ROS水平显着高于其他溶剂组,鉴于单纯添加乙醇显着增加了肝细胞ROS水平,本研究最终确定KOH为肝脏脂肪病研究中脂肪酸的最合适的溶剂选择。为明确不同脂肪酸对犊牛原代肝细胞脂质沉积及肝损伤特征,本研究分离培养原代犊牛肝细胞,分别添加1.2 mmol/L OA、LA、PA、POA、SA以及混合游离脂肪酸(NEFA)刺激原代犊牛肝细胞12 h。采用Bodipy 493/503荧光染色法检测细胞内脂滴生成情况,试剂盒检测细胞内TG、极低密度脂蛋白(VLDL)、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H_2O_2)的水平,荧光染色检测细胞ROS水平,荧光定量PCR和Western blot方法检测脂肪从头合成相关指标固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1C)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、硬脂酸CoA去饱和酶1(SCD1);内质网应激标志物GRP78、C/EBP同源蛋白(CHOP)和极低密度脂蛋白合成的相关指标分拣蛋白1(SORT1)、载脂蛋白B 100(APOB100)、前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的mRNA和蛋白的表达。结果显示与饱和脂肪酸(SFAs)PA和SA相比,不饱和脂肪酸(USFAs)OA、LA、POA以及游离脂肪酸组肝细胞脂滴和甘油叁酯显着升高。UFAs处理的肝细胞SREBP1C、FAS和ACC1表达量均显着高于SFAs组,这表明UFAs导致肝细胞严重的脂沉积。单一脂肪酸添加组的炎症反应标志物P65,内质网应激标志物GRP78、CHOP和氧化应激标志物H_2O_2和MDA显着高于NEFA组,表明单一脂肪酸刺激原代犊牛肝细胞导致的肝细胞损伤显着高于NEFA。SFAs组肝细胞VLDL及其组装分泌的相关蛋白APOB100水平显着低于其他组,且SFAs组肝细胞的GRP78和CHOP水平显着高于其他各组,表明SFAs导致了内质网应激,进而减少VLDL的分泌。综上所述,单一脂肪酸刺激下原代犊牛肝细胞脂沉积与肝损伤的程度显着高于NEFA刺激下的原代犊牛肝细胞,且饱和脂肪酸介导肝细胞严重炎性及氧化应激损伤,而不饱和脂肪酸导致原代犊牛肝细胞严重脂质沉积。(本文来源于《黑龙江八一农垦大学》期刊2019-06-01）
张毅,张晓妹,陈良,郑俊,杨卿[6]（2019）在《化合物BAM15减轻大鼠原代肝细胞冷保存损伤的实验研究》一文中研究指出目的探讨化合物BAM15对大鼠离体肝脏原代细胞冷保存损伤的影响。方法采用胶原酶灌注法提取大鼠肝脏原代细胞,根据细胞培养条件的不同,将细胞分为4组:A组(含250 nmol/L BAM15的Hibernate细胞培养液);B组(含500 nmol/L BAM15的Hibernate细胞培养液);C组(含1 000 nmol/L BAM15的Hibernate细胞培养液);对照组(Hibernate细胞培养液)。各组细胞均冷保存12 h。荧光显微镜下观察肝脏原代细胞的纯度。同时测定各组细胞的增殖能力、凋亡情况以及线粒体活性氧(ROS)变化情况。结果 B组和C组的细胞增殖能力均强于对照组(均为P<0.05)。A、B、C组的细胞凋亡率分别为(33.7±2.2)%、(19.7±1.1)%、(28.7±1.2)%,均明显低于对照组[(82.7±4.2)%,均为P<0.05]。A、B、C组的细胞内ROS阳性率分别为(11.8±4.0)%、(7.6±1.3)%、(8.9±1.6)%,均明显低于对照组[(27.4±4.5)%,均为P<0.05]。结论化合物BAM15能有效减轻大鼠肝脏原代细胞的冷损伤,其保护机制可能与BAM15减少冷缺血期间ROS生成有关。(本文来源于《器官移植》期刊2019年03期）
傅恭博[7]（2019）在《人原代肝细胞来源的肝前体样细胞扩增、分化及疾病模拟》一文中研究指出研究背景及目的肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,我国每年肝细胞肝癌死亡人数占到全球肝细胞肝癌死亡人数的将近一半。肝细胞肝癌的发生发展错综复杂,具体机制有待进一步研究。我国乙肝患者基数庞大,绝大多数肝细胞肝癌患者携带乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染标志。目前而言,肝移植是治疗肝细胞肝癌引起的终末期肝病(End Stage Liver Disease,ESLD)较为有效的手段。尽管器官捐献的数量在逐年上升,但供体数量仍然远远不能满足患者需求。随着生命医学领域的长足进步,肝再生(Liver regeneration)研究不断深入,一方面帮助人们进一步理解肝细胞肝癌的发生发展机制,另一方面帮助人们进一步完善终末期肝病的治疗手段。虽然肝脏在人体内具有极强的再生能力,然而原代肝细胞(Primary hepatocytes,PHCs)却无法在体外长期功能维持与数量扩增,这导致基于肝细胞的细胞治疗和疾病模拟无法顺利开展。寻找肝细胞源成为了亟待解决的问题,科学家们尝试采取多种途径体外获得肝样细胞(Hepatocyte-like cells)。惠利健教授团队等通过异位表达肝脏特异性转录因子(Hepatic specific transcription factors),将成纤维细胞直接转分化为诱导肝样细胞(induced Hepatocyte-like cells,iHeps)或诱导肝前体样细胞(induced Hepatic stem-like cells,iHepSCs),为体外肝细胞的获取提供了一种便捷的方式。然而,该过程涉及外源基因导入,其应用受到遗传变异、致瘤性等限制。为了规避基因插入导致的风险,基于小分子诱导的化学重编程技术(Chemical reprogramming technology)因其在控制细胞命运方面的效率性和安全性,近年来引起了人们的广泛关注。国内外科学家已经实现单纯小分子条件下重编程成纤维细胞为多能干细胞或神经元样细胞,并有文章报道了化学重编程的动态分子机制。消化系统方面,化学重编程也取得了一定的成绩,王韫芳教授团队报道了一种在基质细胞存在条件下逆转胃上皮细胞为诱导内胚层祖细胞(induced Endodermal progenitor cells,iEndoPCs)的方法,上述祖细胞可进一步分化为肝样细胞、胰腺内分泌样细胞和肠上皮样细胞。近期,Ochiya教授团队和本课题组几乎同时报道了一类小分子逆转鼠原代肝细胞为肝前体样细胞的方法,可在体外实现肝细胞大量扩增,并且这种肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derived liver progenitor-like cells,HepLPCs)极易肝向分化,为体外肝细胞获取提供了一种全新的思路。尽管如此,目前尚没有针对人原代肝细胞体外扩增与分化的系统研究。综合上述问题,本研究在鼠原代肝细胞成功逆转与扩增前提下,拟进一步研究人原代肝细胞的体外培养体系。本研究的开展将拓宽体外肝细胞来源,为肝病体外模拟及治疗提供新策略,对肝脏再生医学发展和肝癌治疗探索具有重要的科学意义。研究方法1.获取经手术切除的血管瘤旁正常组织分离人原代肝细胞,通过Percoll密度梯度离心和流式细胞仪分选,排除肝脏前体细胞污染;小分子条件培养基体外培养人原代肝细胞,荧光定量PCR等手段研究人原代肝细胞的体外转化;实时成像技术拍摄人原代肝细胞向肝前体样细胞转化过程,记录细胞分裂次数,计算转化效率。2.克隆形成实验观察小分子条件培养基中各个小分子对人原代肝细胞向肝前体样细胞转化的影响;不同时间点细胞计数,绘制HepLPCs的生长曲线,计算倍增时间,EdU实验检测细胞增殖能力;核型分析实验检测不同供者来源的HepLPCs核型稳定性。3.构建肝细胞特异性启动子TBG启动的TBG-EGFP-T2A-puro慢病毒系统,谱系示踪实验观察绿色荧光标记的肝细胞在小分子条件培养基中的转化;记录不同供者来源的HepLPCs传代情况,核型分析实验检测不同代数核型稳定性。4.CCK-8、免疫荧光、荧光定量PCR以及Western Blot等实验研究常用表观遗传调节剂对人原代肝细胞向肝前体样细胞转化的影响;SIRT1选择性抑制剂和SIRT1干扰实验验证SIRT1相关信号通路在上述转化中的作用。5.转录组测序、荧光定量PCR、免疫荧光以及流式细胞技术等分析HepLPCs的表型特征。6.肝向成熟培养基分化HepLPCs,荧光定量PCR、流式细胞技术以及转录组测序等检测肝向分化情况;糖原储存、白蛋白分泌、氨清除以及药物代谢等实验检测肝向分化后的细胞功能;借助FAH基因缺陷联合免疫缺陷小鼠,研究肝向分化后的HepLPCs体内移植修复肝脏及治疗肝衰竭能力。7.HepLPCs低粘附成球培养叁维肝向分化后,荧光定量PCR、Western Blot以及免疫荧光等检测HBV感染相关宿主基因表达及翻译情况;HBV病毒感染3D-HepLPCs-Hep细胞球,检测HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌情况及cccDNA。8.分离HBV感染患者原代肝细胞,小分子条件培养基体外培养,观察HBV感染情况。9.构建靶向cccDNA的CRISPR/CAS9腺病毒,联合恩替卡韦,借助HBV感染的3D-HepLPCs-Hep细胞球模型,进行抗病毒研究。研究结果1.经Percoll密度梯度离心,流式细胞仪分选去除CD24阳性和EpCAM阳性的细胞,获得ASGPR1阳性的人原代肝细胞;人原代肝细胞在小分子条件培养基中肝系标志物逐渐下降,前体相关标志物逐渐升高,大约10天后呈现克隆化生长;细胞培养第2天到第8天实时成像结果显示,约50%的细胞在小分子条件培养基作用下分裂大于2次,实现高效转化。2.各个小分子从条件培养基中依次删减后,克隆形成效率随之降低,说明各因子对转化均有正向影响;HepLPCs倍增时间约为25小时,部分供者来源的细胞在第10代仍然保持旺盛的增殖能力;核型分析结果显示,不同供者来源的HepLPCs具有高度的核型稳定性。3.TBG启动绿色荧光标记的肝细胞在小分子条件培养基中向肝前体样细胞转化并扩增,表面标志物变化情况与上文分选纯化的细胞相似;HepLPCs传代次数存在个体差异,多数集中在10到20代之间,10代以内不同代数间核型具有高度稳定性。4.尼克酰胺促进转化过程中细胞衰老和凋亡,部分通过抑制SIRT1相关信号通路从而影响转化效率;SIRT1选择性抑制剂和SIRT1干扰实验结果均显示,SIRT1抑制影响转化效率,并且在传代过程中整体撤除7个小分子会影响SIRT1相关信号通路进而出现细胞凋亡。5.HepLPCs表达谱水平介于原代肝细胞和胎肝细胞之间,既表达部分肝前体样标志物又表达部分肝系标志物。6.HepLPCs可在1周左右快速肝向分化,聚类结果显示HepLPCs-Hep的肝功能相关基因集接近原代肝细胞,如ABC转运蛋白、胆汁分泌、细胞色素P450等;功能学实验表明,HepLPCs-Hep的糖原储存、白蛋白分泌、氨清除以及药物代谢等能力靠近原代肝细胞;HepLPCs-Hep体内细胞移植后,可重建肝脏并显着缓解模型小鼠肝衰竭状况。7.HepLPCs在低粘附板中形成细胞球,肝向分化后HBV受体基因NTCP显着上调,为后续HBV感染提供基础;3D-HepLPCs-Hep细胞球可被HBV感染,能分泌HBV-DNA、HBsAg、HBeAg,细胞内形成可被检测的cccDNA。8.HBV感染患者来源的原代肝细胞可被小分子条件培养基转化并扩增,扩增状态中存在原有HBV丢失,部分患者来源的HepLPCs叁维肝向分化后HBV可再激活。9.CRISPR/CAS9可靶向切割cccDNA,单独使用或者联合恩替卡韦使用都能很好的治疗HBV感染。研究结论本研究在前期工作基础上体外运用小分子条件培养基诱导人原代肝细胞向肝前体样细胞转化并扩增,这种肝细胞来源的肝前体样细胞——HepLPCs增殖迅速且核型稳定。随后鉴定这种体外肝细胞命运转变与SIRT1相关,并且详细描述了HepLPCs的表型特征,建立了HepLPCs的快速肝向分化体系。应用方面,肝向分化后的HepLPCs移植入FAH基因缺陷联合免疫缺陷小鼠体内,可重建其病变肝脏并显着改善肝衰竭症状。HepLPCs叁维肝向分化后还可用于HBV感染与抗病毒研究,验证了CRISPR技术靶向切割cccDNA在HBV感染治疗中的作用。本研究拓宽了体外肝细胞来源,为肝病体外模拟及治疗提供了新策略,对肝脏再生医学发展和肝癌治疗探索具有重要的科学意义。(本文来源于《中国人民解放军海军军医大学》期刊2019-05-01）
潘贵[8]（2019）在《miR-124-3p在原代小鼠肝细胞重编程为胰岛素分泌细胞过程中的关键调控作用研究》一文中研究指出目的:通过小分子化合物分阶段将小鼠肝细胞重编程为胰岛素分泌细胞(insulin producing cells,IPCs),建立一种用非转基因方式重编程原代肝细胞为胰岛素分泌细胞的方法并探索miRNA-124-3p在诱导分化过程中的机制。方法:小鼠原代肝细胞分离、培养、鉴定,利用各类小分子化合物分阶段将肝细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,通过qPCR、细胞免疫荧光检测分化各阶段标志物的表达,通过胰岛素释放实验检测IPCs的功能。设计miRNA-124-3p类似物(mimic)和抑制剂(inhibitor)序列,将mimic和inhibitor分别转染至小鼠肝细胞,并通过qPCR检测转染后miRNA-124-3p和靶基因Foxa2表达量变化,以此来判断载体是否构建成功,再将miR-124-3p上调和下调后的肝细胞诱导分化为IPCs,采用qRT-PCR,细胞免疫荧光检测miRNA-124-3p上调及下调后诱导各阶段胰岛素发育相关基因及蛋白表达量变化。小鼠胰岛素酶联免疫分析(ELISA)检测各阶段细胞分泌胰岛素的差异。结果:1.糖原染色显示分离得到的细胞为含有糖原颗粒的肝细胞,通过细胞免疫荧光染色也得到了进一步的证实。诱导得到的IPCs表达β细胞功能相关基因GK、Glut2和insulin1,细胞免疫荧光显示insulin和C-肽蛋白表达阳性,胰岛素释放实验证明肝细胞成功的重编程为有功能的IPCs。2.转染mimic后,miR-124-3p表达量显着上调,靶基因Foxa2的表达量较对照组下调,转染miR-124-3p inhibitor后,靶基因Foxa2的表达量显着上调,成功构建miR-124-3p过表达和抑制载体。miR-124-3p抑制表达后诱导的IPCs中Foxa2、Pdx1、NeuroD、insulin1、insulin2基因表达水平显着上调,miR-124-3p过表达后结果则相反。细胞免疫荧光、体外葡萄糖刺激实验等结果均表明,抑制miR-124-3p的表达后,insulin,pdx1,C-peptide的表达量较对照组和过表达组升高,分化效率升高。结论:1.通过小分子化合物诱导,成功将原代小鼠肝细胞重编程为胰岛素分泌细胞。2 miR-124-3p在肝细胞体外分化为IPCs的过程中发挥负调控作用。抑制miR-124-3p表达可以显着提高Foxa2以及Pdx1的表达,促进肝细胞向IPCs分化,提高诱导效率;过表达miR-124-3p显着抑制Foxa2以及Pdx1的表达,降低诱导效率。(本文来源于《南昌大学》期刊2019-05-01）
沈聪[9]（2019）在《乳铁蛋白对LPS诱导的奶牛原代肝细胞炎症反应的抑制作用》一文中研究指出乳铁蛋白是一种天然免疫蛋白,普遍存在于奶牛乳汁等外分泌液中。奶牛不仅整个生产周期都受到乳腺炎和子宫内膜炎等感染性炎症的威胁;同时在奶牛特殊的过渡时期——围产期,机体经历能量负平衡,发生代谢应激和全身性的持续性亚急性炎症刺激,给奶牛的健康和生产性能带来巨大影响。本文通过研究乳铁蛋白对LPS诱导的奶牛肝原代细胞炎性反应的抑制作用及其可能的分子机制,为乳铁蛋白的临床抗炎应用提供理论依据和技术支持。本文以改良的胶原酶两步灌流法分离得到的奶牛原代肝细胞为实验材料。通过MTT法检测LPS对奶牛原代肝细胞活力的影响,利用荧光定量PCR技术检测LPS诱导细胞后特征炎性因子基因的表达,筛选了诱导奶牛原代肝细胞炎症损伤模型的条件;在炎症损伤模型的基础上,加入乳铁蛋白共培养。利用荧光定量PCR及Western Blot技术检测了对相关炎症信号通路中关键蛋白和炎性因子基因的表达。研究结果如下:1000 ng/mL LPS作用于奶牛原代肝细胞24 h,对细胞活性没有显着影响,但可显着提高细胞炎性因子TNF-α与IL-1β基因表达。选择1000 ng/mL LPS刺激奶牛原代肝细胞24 h,建立LPS诱导奶牛原代肝细胞炎症反应模型。乳铁蛋白(1,10,100μg/mL)对促炎性细胞因子的基因表达有抑制作用,对抗炎细胞因子基因表达有刺激增强作用,同时对奶牛原代肝细胞AST与ALT的分泌有抑制作用。乳铁蛋白(1,10,100μg/mL)对LPS诱导的奶牛原代肝细胞TLR4信号通路上TLR4、CD14、MyD88、TICAM1、TICAM2蛋白分子基因表达有抑制作用。同时,乳铁蛋白对LPS诱导的奶牛原代肝实质细胞IκBα的降解和NF-κB p65磷酸化有抑制作用。表明其抗炎作用可能的分子机制是通过抑制TLR4信号通路的MyD88依赖通路和MyD88独立通路(TRIF依赖通路),抑制NF-κB信号通路的激活。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
张秀莉,郭红云,张永东,王涛,梁涛[10]（2019）在《一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法》一文中研究指出目的:寻找一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法。方法:在Seglen两步胶原酶灌注法的基础上加以改进,按门静脉灌注法分离培养大鼠肝细胞,重复10次分离肝细胞实验,观察各项指标结果。采用胰酶、Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,大鼠肝脏肝门部结构、肝上及肝下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离获取肝细胞,经80目和200目的筛网依次过滤细胞后,细胞悬液分别以1 000、500、300 r/min离心各5 min以纯化肝细胞,以台盼蓝排染法测定细胞活性,HE染色鉴定肝细胞纯度。结果:平均每只成年Wistar雄性大鼠可以获得(1.53±0.31)×10~8个肝细胞,平均获得肝细胞活率可达到94.63%,平均获得肝细胞纯度为96.7%。结论:本实验介绍的方法简便易行,且肝细胞产量较高,活力好,纯度高,适宜在一般条件的实验室推广和应用。(本文来源于《现代肿瘤医学》期刊2019年09期）
原代鸭肝细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:研究古古勒-4味汤(黑云香四味汤散)对H_2O_2所致的原代肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制.方法:取新生乳鼠肝脏,加入0.1%Ⅱ型胶原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液分离培养原代肝细胞,加入不同剂量(100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L) H_2O_2建立原代肝细胞氧化应激损伤模型.原代肝细胞氧化应激损伤模型建立成功后,加入0.5 mg/mL、1 mg/mL及1.5 mg/mL古古勒-4味汤确定古古勒-4味汤最佳剂量.MTT检测H_2O_2和古古勒-4味汤最佳剂量及肝细胞活性;收集细胞,采用ELISA检测不同组细胞中GSHPx和SOD的表达情况;采用real-time PCR法检测各组肝细胞Nrf2、Keap1的mRNA表达情况.结果:对数生长期的原代肝细胞加入终浓度为200μmol/L H_2O_2培养6个小时后,给予1mg/mL古古勒-4味汤处理肝细胞后,肝细胞活力较模型组明显上升;古古勒-4味汤处理后,细胞中SOD、GSH-Px活性增强;古古勒-4味汤处理后,肝细胞活性氧明显降低;古古勒-4味汤处理后,肝细胞Nrf2、Keap1的mRNA水平下调.结论:古古勒-4味汤通过影响Keap1-Nrf2/ARE信号通路,保护由H_2O_2所致的原代肝细胞氧化应激损伤.
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
原代鸭肝细胞论文参考文献
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