RAD6B基因缺失对小鼠生长发育及雌性生殖的影响研究

论文摘要

目的:E2泛素交联酶RAD6在多种细胞过程中发挥重要作用,包括组蛋白泛素化修饰、DNA损伤修复和精子形成等;在哺乳动物中,RAD6相关基因RAD6A与RAD6B,编码蛋白高度同源。在本文中我们以RAD6B-/-小鼠为实验动物模型,对RAD6B基因缺失对小鼠生长发育及雌性生殖的影响进行深入研究。方法:1)、通过同窝RAD6B+/-小鼠杂交获得RAD6B-/-小鼠,子代回交亲本提高RAD6B-/-小鼠比例,同窝野生型作为对照;2)、从出生起监测小鼠体重变化及雌性生殖相关指标;3)、取小鼠垂体做冰冻切片并进行HE染色,对比RAD6B+/+与RAD6B-/-小鼠垂体体积及质量之间是差异;4)、分离小鼠外周血清,通过ELISA方法测定与生长及生殖相关激素的分泌量;5)、提取垂体组织RNA,通过RT—PCR测定垂体五种特异性细胞的mRNA表达量;6)、对RAD6B+/+与RAD6B-/-小鼠进行计算机断层扫描（CT）,探究骨骼线性生长发育差异;7)、分离和培养垂体原代细胞,CCK8测定细胞的生长曲线和激素分泌量;并用500uM H2O2诱导垂体原代细胞衰老、然后CCK8测定诱导后细胞生长趋势及激素分泌量;8)、垂体组织冰冻切片β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色检测垂体细胞中β-Gal表达量;9)、免疫荧光（IF）染色观察生长激素（GH）细胞分布密度及P16阳性细胞数量;10)、Western Blot测定GH（生长激素）、P21、PRLR（泌乳素受体）蛋白表达水平。结果:RAD6B基因敲除小鼠出生时体重与野生型相比差异不明显,但从1周龄开始体重差异逐渐增大,3-4周龄体重差异最明显（P<0.01）;然而从7周龄起体重差异逐渐减小直至消失（约10周龄）。垂体对生长发育、新陈代谢、生殖等有重要影响,因此我们取小鼠垂体进行组织学和形态学的差异探究,垂体称重及HE结果显示:RAD6B-/-小鼠垂体组织质量轻,垂体总体积小并且神经垂体和垂体中叶体积与WT相比差异不明显,说明垂体体积差异主要出现在垂体前叶;除此之外,垂体GH（生长激素）mRNA表达量下调（P<0.01）;且GH（生长激素）免疫荧光染色（IF）结果表明垂体促生长激素细胞数量显著减少（P<0.001）,GH（生长激素）外周血分泌量也明显下降（P<0.05）。肝源性的IGF-1（胰岛素样因子-1）是GH（生长激素）的下游蛋白,GH对体细胞生长的影响是通过其直接作用和IGF-1的间接作用来实现;RT-PCR结果显示:3周龄小鼠垂体生长激素（GH）及肝脏IGF-1 mRNA表达量下降均约50%（GH,P<0.01,IGF-1,P<0.05）;GH（生长激素）是GH（生长激素）/IGF-1（胰岛素样因子）轴的关键组成因子,GH/IGF-1轴对生长发育与生殖起关键调控作用。CT结果表明:1)、RAD6B-/-小鼠骨骼纵轴长度（门齿至骶骨尾端）在4周龄时显著短于RAD6B+/+（P<0.01）,10周龄时差异消失,而24周龄（6月龄）差异再次出现（P<0.01）。2)、4周龄时RAD6B-/-小鼠的股骨与胫骨长度同样短于RAD6B+/+小鼠（P<0.01）,10周龄小鼠股骨和胫骨的长度差异逐渐减少趋于相等。3)、24周龄小鼠的股骨及胫骨没有明显差异;除此之外,我们还发现4周龄RAD6B-/-小鼠的卵巢子宫、睾丸及乳腺发育不良;而垂体泌乳素（PRL）及其受体（PRLR）对乳腺发育、刺激和维持泌乳有至关重要的影响,因此我们测定垂体泌乳素（PRL）mRNA的表达量,结果显示:泌乳素（PRL）mRNA的表达量略微增加（P>0.05）,然后我们提取乳腺组织蛋白及RNA,用WB及PT-PCR测定泌乳素受体（Prlr）蛋白及mRNA表达量,结果显示RAD6B-/-小鼠的垂体泌乳素受体蛋白及mRNA的表达量均下降（P<0.01）;且RAD6B-/-雌性小鼠的第一次动情期推迟、生殖间隔周期延长、产仔量及母性行为下降。分离垂体原代细胞培养并用ROS（H2O2）诱导细胞衰老;我们发现:未进行任何处理的RAD6B-/-垂体原代细胞的细胞增殖能力弱于RAD6B+/+（P<0.05）,加入500 uM H2O2诱导衰老后测定细胞增殖能力,结果表明:2小时时RAD6B-/-垂体原代细胞的增殖能力略增加（P>0.05）,但4小时时增殖能力显著下降（P<0.05）,此趋势持续至增殖停止;加入500 uM H2O2后RAD6B+/+与RAD6B-/-垂体原代细胞的GH（生长激素）的分泌量均下降,但RAD6B-/-细胞的下降程度更明显（P<0.01）。接下来我们对6月龄小鼠垂体组织进行P16荧光染色与β-Gal,并提取垂体蛋白测定P21的蛋白表达量;结果显示:RAD6B KO小鼠的垂体β-Gal阳性细胞数量明显多于WT（P<0.001）,P16的阳性细胞数量同样多于WT（P<0.01）;而P21的蛋白表达量KO少于WT（P<0.01）。结论:1)、RAD6B-/-小鼠体重下降、垂体前叶体积减小与垂体前叶原代细胞增殖能力下降;并且垂体前叶促生长激素细胞数量减少,GH（生长激素）分泌量下降;以上结果表明:RAD6B基因缺失引起小鼠垂体发育不全,功能下降。2)、GH（生长激素）蛋白及肝脏IGF-1（胰岛素样因子1）mRNA表达量下降,引起GH/IGF-1轴功能缺陷,导致生长发育迟缓,生殖器官发育不全与青春期延迟（性成熟延迟）3)、乳腺泌乳素受体（PRLR）蛋白及mRNA表达量下降,导致乳腺发育不成熟。4)、加入ROS（H2O2）诱导剂后,垂体前叶垂体原代细胞增殖能力显著下降并且GH（生长激素）分泌量明显下降;表明RAD6B基因缺陷导致垂体前叶细胞增殖能力下降、并导致垂体促生长激素细胞功能下降5)、RAD6B-/-小鼠的垂体组织中β-Gal和P16阳性细胞数量增加,提示RAD6B基因缺失导致垂体细胞衰老。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
•   1.垂体
•     1.1. 脑垂体的形成及其功能
•     1.2 .垂体前叶细胞
•     1.3. 垂体细胞与生长发育及泌乳
•     1.4 .GH/IGF-1（生长激素/胰岛素样因子-1）轴与生长发育
•   2.RAD6
•     2.1 .RAD6与DNA损伤修复
•     2.2 .RAD6 与泛素
•     2.3 .RAD6与DDT
•     2.4 .RAD6 与哺乳动物生殖系统
•   3.细胞衰老及分子机制
•     3.1 .细胞衰老及意义
•     3.2 .DNA损伤及衰老
• 材料和方法
•   1.实验仪器、材料和试剂
•     1.1 .实验材料
•     1.2 .主要试剂
•     1.3 .主要仪器
•     1.4 .溶液配制
•   2.实验方法
•     2.1 .动物组织切片
•     2.2 .垂体组织HE染色
• -/-小鼠基因鉴定'>    2.3 .Promega试剂盒提取DNA、RAD6B^-/-小鼠基因鉴定
•     2.4 .免疫荧光
•     2.5 .Rt-PCR与 RNA提取
•     2.6 .RT-PCR
•     2.7 .垂体原代细胞分离
•     2.8 . β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色衰老检测
•     2.9 .ELISA
•     2.10 .WB（Western Blot）
• 结果
•   1. RAD6B基因缺失导致小鼠垂体功能低下
•   2. RAD6B 基因与GH/IGF-1轴关键因子的表达正相关
•   3.RAD6B基因缺失导致小鼠生长发育缓慢
•   4.RAD6B基因缺失导致小鼠青春期滞后与雌性生殖功能下降
•   5. RAD6B基因缺失导致垂体原代细胞增殖能力下降
•   6.RAD6B基因缺失导致垂体原代细胞更易走向衰老
• 讨论
•   1.RAD6B基因敲除小鼠体重下降与青春期的发生发展有关
•   2.RAD6B-null小鼠垂体发育不全与GH（生长激素）缺陷引起
•   3.GH/IGF-1轴缺陷导致青春期线性增长下降
•   4.RAD6B-null雌性小鼠青春期延迟,生殖能力下降
•   5.RAD6B-null泌乳素受体表达量下降导致乳腺发育不良
•   6、RAD6B-null垂体细胞早衰
• 结论
• 致谢
• 参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李海鸿

导师: 宋焱峰,王德贵

关键词: 生长激素,垂体,泌乳素受体,垂体细胞衰老

来源: 兰州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 兰州大学

分类号: Q344

总页数: 49

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